vse-zabolevaniya.ru
ГлавнаяАнализыИммунологический методИммуноферментный анализ (иммунологический метод)

Иммуноферментный анализ (иммунологический метод)


Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на взаимодействии антигена с антителом, при этом один из них имеет в своем составе фермент. При образовании комплекса антиген-антитело содержимое пробирки (или ячейки планшетки) меняет цвет под воздействием фермента. Полученный результат сравнивают со стандартной цветовой шкалой и определяют по ней антиген и его количество.
Этот способ диагностики широко используют в медицине для выявления болезнетворных микроорганизмов (особенно вирусов), определения уровня гормонов, лекарственных веществ в крови, аллергенов, инфекционных заболеваний (вирусных гепатитов, краснухи, гепатита, цитомегалии и др.), заболеваний иммунной системы и злокачественных новообразований.
Преимущества иммуноферментого анализа по сравнению с другими видами иммунодиагностики:
1) высокая чувствительность реакций - одна молекула фермента может вызвать значительные изменения во взаимодействующих компонентах;
2) исследуемый материал (плазма или сыворотка крови) необходим в минимальном количестве;
3) длительное хранение лабораторных расходных материалов для исследования;
4) результат можно оценивать как с помощью приборов, так и «на глаз»;
5) можно определить количество антигенов или антител в исследуемом материале от пациента;
6) простота проведения;
7) возможно проведение анализа с помощью автоматических анализаторов;
8) экономичность.
Иммуноферментный анализ осуществляют несколькими способами. Наиболее часто проводят твердофазный (гетерогенный) иммуноферментный анализ, подразумевающий использование фиксированного на твердой поверхности и нерастворимого реагента с антигенами или антителами. Соответствующие компоненты из исследуемого материала (антитела или антигены) впитываются твердым реагентом. Не вступившие в связь с таким реагентом компоненты легко удаляются с планшетки. В качестве фермента-метки используют щелочную фосфатазу, В-галактозидазу, а наиболее часто - пероксидазу хрена. Последний фермент доступный, очень активный и достаточно стабильный.
Антиген вируса гепатита В впервые выявили при исследовании крови аборигенов Австралии. Это послужило поводом назвать антиген австралийским, что прочно осело в медицинской терминологии.
Иммуноферментный анализ проводят в присутствии орто-фенилендиамина и перекиси водорода. При их взаимодействии образуется вещество, которое определяется фотометрически. Для прекращения ферментативной реакции используют тормозный реагент - серную кислоту.
Результат иммуноферментного анализа определяется с помощью спектрофотометрии. В некоторых случаях (при выявлении австралийского антигена) для достоверности результатов делают подтверждающий лабораторный тест.
Строгое следование правилам проведения анализа и использования реагентов исключает ошибочные заключения.
Твердофазный иммуноферментный анализ проводят разными методами и способами. Для проведения иммуноферментного анализа с целью диагностики вирусных гепатитов используют множество реагентов.
"Сэндвич-метод"
К фиксированным на твердой нерастворимой поверхности антителам добавляют исследуемый материал с антигенами с соблюдением определенных условий. Затем с планшетки удаляют непрореагировавшие компоненты и добавляют ферментсодержащие антитела к предполагаемому антигену. Далее опять выдерживают планшетку в определенных условиях и удаляют не вступившие в реакцию компоненты. На планшетке остается антиген, заключенный между слоями антител. Если комплексы антитело-антиген-антитело + фермент представлены, то далее при добавлении химического субстрата происходит изменение его цвета.
Способы ИФА:
1) фиксированные на твердой поверхности антигены + материал от пациента с антителами + ферментсодержащие антиантитела (антитела к иммуноглобулинам G пациента). С использованием этих реагентов выявляют антитела к вирусу гепатита С;
2) фиксированные на твердой поверхности антигены + материал от пациента с антителами + ферментсодержащие антигены. Таким образом выявляют антитела к Hbs-антигену (австралийский антиген - признак гепатита В);
3) стандартные антигены + материал от пациента с антителами + фиксированные на твердой поверхности ферментсодержащие антитела. Таким образом выявляют антитела к антигенам вирусов гепатитов В, Dh Е;
4) фиксированный на твердой поверхности антиген + ферментосодержащие антитела + материал от пациента. Используется для выявления антител к вирусам гепатитов А, В, С.
Одностадийный "сэндвич-метод"
Это ускоренный вариант предыдущего анализа. В данном случае исследуемый материал и ферментсодержащие антитела добавляют на планшетку с фиксированными антителами одновременно. Это упрощает анализ и сокращает время его проведения.
Многослойный "сэндвич-метод"
Для проведения анализа используют планшетку с фиксированными антителами к антителам пациента (иммуноглобулинам), на которую добавляют материал от пациента. Ее выдерживают в определенных условиях и удаляют непрореагировавшие компоненты. Затем добавляют в ячейки планшетки стандартный антиген, а после соблюдения ряда условий реакции удаляют
непрореагировавшие компоненты. Далее добавляют в ячейки ферментсодержащие антитела. Это более сложный и длительный анализ, чем по методу «простого сэндвича».
Фиксированные на твердой поверхности антиантитела (антитела к иммуноглобулинам М) + материал от пациента с антителами + стандартный антиген + ферментсодержащие антитела.
Таким образом выявляют антитела (иммуноглобулины М) к вирусам гепатитов А, В. Существуют и другие варианты твердофазного иммуноферментного анализа.