vse-zabolevaniya.ru Подберем лучшего врача в Москве
звоните: 7 (499) 116-78-36
ГлавнаяМикробиологияКоринебактерии дифтерии и дифтерия

Коринебактерии дифтерии и дифтерия

ссылки

Коринебактерии дифтерии

Впервые описана Э. Клебсом в 1983 г. и выделена Ф. Леффлером в 1984 г.

Морфология и физиология

Коринебактерии дифтерии имеют характерную для всего рода форму. Они располагаются под углом друг к другу в виде римских пятерок. Зерна волютина выявляются при окраске уксуснокислой синькой по методу Нейссера, которая окрашивает только включения, не затрагивая цитоплазму. Дифтерийная палочка окружена микрокапсулой и имеет пили. С. diphtheriae требовательны к питательному субстрату. Они нуждаются во многих аминокислотах, углеводах, минеральных солях. Обычно их культивируют на свернутой сыворотке крови и на кровяном агаре с теллуритом калия. На последней среде образуют колонии двух типов: gravis - темно-серого цвета и mitis - черного цвета, которые отличаются друг от друга и по биохимическим признакам.

Антигены

С. diphtheriae содержат в микрокапсуле К-антиген, позволяющий дифференцировать их на серовары и групоспецифический полисахаридный антиген клеточной стенки, который дает перекрестные серологические реакции с микобактериями и нокардиями. Патогенность и патогенез. Факторы вирулентности дифтерийных бактерий - пили и микрокапсула, с помощью которых они прикрепляются к эпителиоцитам миндалин, реже гортани, трахеи, полости носа, конъюнктивы глаза, вульвы. Затем происходит колонизация эпителиоцитов, что сопровождается возникновением воспалительного процесса. Токсичность связана с секрецией гистотоксина, который состоит из двух субъединиц: токсического полипептида и транспортного полипептида, ответственного за доставку токсического компонента к клеткам-«мишеням». Образование первого контролируется бактериальными генами, второго - генами фага, лизогенизировавшего бактериальную клетку. Это свидетельствует о том, что только лизогенные клетки С. diphtheriae могут секретировать гистотоксин.Фиксация гистотоксина происходит на рецепторах мембран мышечных клеток сердца, паренхимы сердца, почек, надпочечников, нервных ганглиев. При этом блокируется синтез белка на рибосомах, что, в конечном итоге, приводит к гибели клеток. При дифтерии, как правило, отсутствует бактериемия и септицемия в связи с локализацией С. diphtheriae в клетках гортани, где развивается фибринозно-некротическое воспаление с образованием пленок, лимфаденита и отеков, что может привести к асфиксии. Кроме дифтерии гортани С. diphtheriae вызывает дифтерию раневых поверхностей и половых органов. К дифтериеподобным коринебактериям относятся следующие: С. xerosis вызывает хронические конъюнктивиты, С. ulcerans - легкие формы дифтериеподобных заболеваний, С. pyogenes и С. haemolyticum - язвенно-некротические фарингиты, тонзиллиты, гингивостоматиты. С. pseudodyphtheriae является постоянным обитателем кожи и слизистых.

Иммунитет

Напряженность постинфекционного иммунитета при дифтерии обусловлена высоким уровнем антитоксина в сыворотке крови. Образующиеся при дифтерии антибактериальные антитела - агглютинины, преципитины и другие - не обладают протективными свойствами. О наличии или отсутствии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика - нейтрализации токсина антитоксином. При введении V40 DLM дифтерийного токсина в кожу предплечья появляется покраснение и припухание в случае отсутствия антитоксина в крови. При наличии антитоксина реакция Шика отрицательная.

Экология и эпидемиология

Средой обитания для С. diphtheriae являются люди, в зеве которых они локализуются. Главным образом дифтерией болеют дети. Однако за последние 30 лет дифтерия «повзрослела». У взрослых дифтерия протекает тяжело и может закончиться летальным исходом. В окружающей среде бактерии дифтерии сохраняют жизнеспособность в течение нескольких дней, поскольку они переносят высушивание. Заражение происходит воздушно-капельным и реже контактным путем.

Дифтерия

Дифтерия - острая, преимущественно детская инфекционная болезнь, которая проявляется характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбудителя и сильной интоксикацией организма дифтерийными экзотоксин. Возбудителем ее является Corynebacterium diphtheriae, принадлежащего к роду коринебактерий. До этого рода входит еще около 20 видов бактерий, патогенных для людей, животных и растений. Из них наибольшее значение для практической медицины имеют следующие:1. С. ulcerans - может вызвать фарингит, поражение кожи, ее выявляют и у здоровых людей, в молочных продуктах и таре для их перевозки, некоторые штаммы токсигенные.2. С. jeikeium (ранее коринебактерии JK) - влечет пневмонию, эндокардит, перитонит, инфицирует раны, кожу.3. С. cistitidis (ранее коринебактерии группы D2) - инициирует образование камней в мочевыводящих путях и пневмония.4. С. minutissimum - вызывает эритразмы, абсцессы легких, эндокардит.5. С. haemolyticum - может вызвать тонзиллиты, целлюлит, абсцессы мозга, остеомиелит, хронические дерматиты.6. С. xerosis - раньше считали возбудителем ксероза (хронического конъюнктивита), теперь ее относят к сапрофитов.7. С. pseudodiphtheriticum - сапрофит, проживает на слизистой оболочке носоглотки человека.

Взятие и доставка материала в лабораторию

Материалом для исследования пленка из миндалин, дужек, неба, язычка, слизь из зева и носа, реже выделения из глаза, уши, раны, влагалища, пораженного участка кожи. По требованию эпидемиолога исследуют смывы с игрушек и других предметов, некоторые пищевые продукты (молоко, мороженое). Материал нужно брать до начала этиотропного лечения натощак или через 2 ч после приема пищи.Для взятия материала используют тампоны, сухие или предварительно смоченные 5% раствором глицерина, помещенные в пробирку и простерилизованные вместе с ней. Исследуемый материал из ротоглотки и носа берут двумя отдельными тампонами, пытаясь взять его на границе здоровой и пораженной области вращательными движениями, не касаясь тампоном слизистой щек, зубов и языка, который прижимают шпателем. При ларингоскопии пленку или слизь берут непосредственно из гортани. Пленки и слизь изо рта и носа берут обязательно во всех случаях, даже при дифтерии редких локализаций (кожа, рана, глаз, ухо, вульва).Если необходимо провести первичную бактериоскопию по требованию врача, материал берут отдельным (дополнительным) тампоном или направляют часть отснятой пленки, тщательно растертой между двумя предметными стеклами.Тампоны после забора материала помещают в те же пробирки, на которых надписывают номер, дату и время отбора, фамилия врача. Они должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов после взятия материала. Если схема забора предусматривает занял у постели больного, то пробирки и чашки с посевами немедленно направляют в лабораторию или инкубируют при 37 ° С и доставляют через 20-23 ч, в холодное время в сумках с грелками.

Бактериоскопическое исследование

Бактериоскопическое исследование материала от больного проводят только по требованию врача и только для того, чтобы распознать некротическую ангиной Симановского-Плаута-Венсана (выявление веретенообразных палочек и спирохет Венсана, которые при обычных методах культивирования не растут).На протяжении многих лет микроскопическое исследование и выявление зерен волютина, окрашенных по методам Леффлера и Нейссера, было основой лабораторной диагностики дифтерии и выявления бактерионосительства. Теперь, в связи с изменчивостью дифтерийных бактерий под воздействием антибиотиков, первичная микроскопия исследуемого материала не рекомендуется.Бактериоскопическое исследование проводится с целью идентификации нетипичных колоний на кровяно-телуритових средах и при проверке чистоты выделенных культур. Мазки окрашивают по Граму, Леффлером и Нейссером. Можно красить их уксуснокислым метиловым фиолетовым, толуидиновым синим или бентиазоловим и тиазиновых красителей.Дифтерийные палочки в мазках располагаются под углом, в виде латинских букв V, X, Y, или образуют скопления, напоминающие кучку разбросанных спичек. Волютина зерна располагаются, как правило, на полюсах микробных клеток. Псевдодифтерийни бактерии и дифтероиды размещаются параллельно (в виде "частокола") и, конечно, не имеют зерен волютина. Зерна Бабеша-Эрнста можно обнаружить с помощью люминесцентной микроскопии при окраске мазков корифосфином. Зерна приобретают оранжево-красного цвета на фоне желто-зеленых тел бактериальных клеток.

Бактериологическое исследование

Клинический материал засевают на кровяной агар и кровяно-телуритовий агар (или среду Клауберга II), разлитые в чашки Петри. Посев на кровяной агар необходим для обнаружения и другой микрофлоры. Кроме того, некоторые штаммы Cdiphtheriae чувствительны к действию теллурита калия, поэтому их рост на телуритових средах может подавляться. Для выявления дифтерийного бактерионосительства посевы делают только на кровяно-телуритовий агар, поскольку в посевном материале может содержаться небольшое количество дифтерийных палочек, рост которых на неселективных средах будет подавляться другой микрофлорой. При этом допускается использование и транспортной среды.

Кровяно-телуриновий агар

К 100 мл 2% расплавленного и охлажденного до 50 ° С питательного агара рН 7,6 добавляют 10-15 мл дефибринированной крови и 2 мл 2% раствора теллурита калия. Смесь тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем, толщиной 3-4 мм.

Среда Клауберга II

К 100 мл 3% питательного агара рН 7,6, расплавленного и охлажденного до 50 ° С, добавляют 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл гемолизированной крови. Глицериновую смесь готовят путем добавления 20 мл стерильного глицерина до 40 мл дефибринированной крови. Смесь можно хранить в холодильнике в течение 4-х месяцев. Для приготовления гемолизированной ("лаковой") крови до 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови.

Транспортная полужидкая среда

К 100 мл перевар Хоттингера или мясопептонного бульона добавляют 1 г любого коммерческого агара, устанавливают рН 7,6, стерилизуют в автоклаве при 112 ° С 30 мин, асептически добавляют 10 мл сыворотки и 1 мл 2% теллурита калия. Среду разливают в пробирки по 5 мл. При возможности используют и более сложное транспортное среду Эмес (AMIES), модифицированное Стюартом.Посев от одного больного производят на одну чашку, используя при этом одну половину среды для посева из ротоглотки (миндалин, дужек, язычка), а вторую - для посева другим тампоном из носа. Если есть изучаемый материал из кожи, глаза, уши и других локализаций - добавляют еще одну чашку. Нельзя сеять материал от нескольких больных на одну чашку. Среды перед посевом согревают в термостате 15-20 мин.При посеве исследуемого материала втирают тампоном сначала в отдельный участок кровяного агара площадью 2x1 см, затем аналогично на кровяно-телуритовому агаре (или среде Клауберга II), при этом тампон все время поворачивают, чтобы засеять из него весь материал. Затем тем же тампоном штрихами засевают остальные поверхности среды (половину чашки). Такая техника посева позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру), которые используют непосредственно из чашки для определения токсигенности и последующей их идентификации. Засеяны чашки или пробирки с транспортным средой инкубируют в термостате при 37 ° С в течение 20-24 час.На второй день с помощью стереоскопического микроскопа исследуют характер колоний. Если рост отсутствует на обеих средах, делают повторный забор материала.Чашки с типичными и подозрительными на C.diphtheriae колониями отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопию подозрительных колоний можно не проводить.Колонии дифтерийных палочек на кровяном агаре беловатого или желтоватого цвета, непрозрачные, круглой, слегка выпуклой формы, диаметром 1-2 мм. Обычно они имеют маслянистую консистенцию, хотя некоторые могут образовывать хрупкие жесткие R-колонии.На кровяно-телуритових средах KonomiC.diphtheriae через 24 часа роста имеют серый цвет, выпуклые, с ровным краем, вязкие. Через 48 ч они приобретают темно-серого или черного цвета с металлическим блеском, равными или слегка фестончатыми краями, гладкой или с радиально исполосовано поверхностью (R-формы), вязкие или хрупкие при прикосновении петлей.По структуре 48-часовых колоний на телуритових средах и некоторыми ферментативными признаками возбудителя дифтерии выделяют четыре культурально-биохимических варианта (биовары) - gravis, mitis, belfanti, intermedius.Биовар gravis обычно образует серые или черные матовые сухие колонии, хрупкие, плоские, гладкие, диаметром 1,5-2 мм, с радиально исполосовано поверхностью, он высокотоксичный, не вызывает гемолиза, разлагает крахмал и гликоген.Биовары mitis и belfanti растут в виде серых или черных, круглых гладких выпуклых колоний с ровными краями, диаметром 1-1,5 мм эти варианты менее токсичны, вызывают гемолиз, но не разлагают крахмал и гликоген.Биовар intermedius образует мелкие, серые, прозрачные колонии диаметром 0,5-1 мм, с плоской гладкой поверхностью, он слаботоксичный, не расщепляет крахмала и гликогена.Если типичный рост отсутствует, из других, сомнительных колоний готовят мазки. При обнаружении в них споровых палочек, кокков, дрожжей и др.., Исследования на дифтерию прекращают и дают отрицательный ответ. Однако, важно помнить, что дифтерийные бактерии, которые образовали нетипичные колонии на средах с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, но сохраняют полиморфизм и характерное местоположение.При росте типичных колоний сразу же приступают к изучению их токсигенности и идентификации. Токсигенные свойства исследуют не менее в 2-х изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и непрожженные петлей на среду Пизу, а второй половины - на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры и сохранения ее до окончания лабораторной диагностики. В случае, если на чашке вырастают одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности С. diphtheriae, необходимо при множественном росте подозрительных колоний исследовать токсигенные свойства около 20 колоний, засевая в одну бляшку материал из 5-6 колоний. При росте всего одной колонии, ее засевают на среду для определения токсигенности и, прокаливая петлю, - в пробирку со средой Пизу.Если использовали транспортную среду, висел из него делают в плотные кровяно-теллурита среды.На третий день, при появлении специфических линий преципитации в агаровом геле и положительной пробе на цистиназу, выделенную культуру определяют как токсигенные С. diphtheriae. Если линии преципитации через 24 часа отсутствуют, чашки инкубируют еще в течение суток. В случае отрицательной пробы Пизу культуру идентифицируют как вид коринебактерий.Чистую культуру на скошенном сывороточном агаре высевают на углеводородные среды с глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом, ставят пробы на выявление уреазы, пиразинамидазы и нитратредуктазы.На четвертый день делают учет результатов всех посевов и выдают аргументированный бактериологический вывод о выделенную культуру.Используют такие методы идентификации коринебактерий.

Определение токсигенности in vitro

В его основе лежит взаимодействие токсина с антитоксином в агаровом геле. В местах оптимального количественного соотношения токсина и антитоксина в толще агара выпадает преципитат в виде тонких нежных белых линий ("стрелы", "усики"). Этот тест во многих странах за рубежом называют Элек-тестом.Пробу на токсигенность, как правило, проводят с чистыми культурами. Можно определить его и с культурами, загрязненными посторонней микрофлорой, в сутки ускоряет лабораторную диагностику дифтерии. Но при отрицательной пробе ее повторяют с выделенной чистой культурой.Для постановки этой пробы микробиологическая промышленность выпускает специальное сухое стандартное среду для определения токсигенности дифтерийных микробов (ВТДМ) и стандартные бумажные диски, пропитанные антитоксической противодифтерийной сывороткой и высушены.На поверхность свежеизготовленного среды ВТДМ накладывают бумажные диски с антитоксином (не более четырех на одну чашку). На расстоянии 0,5 см от диска вокруг него засевают культуры в виде "бляшек" диаметром 7-8 мм, чередуя "бляшки" изучаемой культуры и контрольного штаммаРезультаты учитывают через 18-24 и 48 год. Критерием специфичности преципитатов является слияние линий преципитации исследуемой культуры с линиями токсигенного штамма. В таком случае выделенную культуру считают токсигенных.При отсутствии стандартных бумажных дисков можно использовать полоски фильтровальной бумаги, пропитанные дифтерийными антитоксином. их изготавливают непосредственно в лаборатории. Нарезанные по указанным размерам и простерилизованные в автоклаве при 121 ° С в течение 30 мин бумажные полоски смачивают 0,25 мл очищенного дифтерийного антитоксина, который содержит 500 МЕ в 1 мл. В таком случае на чашку с соответствующим средой накладывают смоченную антитоксином полоску бумаги, подсушивают, открыв чашку на 15-20 мин в термостате и перевернув ее вверх дном. После этого с обеих сторон полоски засевают культуры "бляшками", чередуя исследуемые и контрольные штаммы.Для определения токсигенности возбудителя дифтерии можно использовать также и другие среды (АГВ, мартеновский агар и др.), рецепты изготовления которых приведены в "Инструкции по бактериологической диагностики дифтерии", Киев (1999).На протяжении многих лет токсигенность дифтерийных бактерий определяли подкожно или внутрикожно введением культуры двум гвинейским свинкам, одной из которых накануне вводят 100-1000 МЕ антитоксической противодифтерийной сыворотки. Теперь этот метод бактериологические лаборатории практически почти не используют из-за дороговизны и значительную задержку ответа.В последнее время разработаны очень чувствителен и высокоспецифичным метод определения гена дифтерийного токсина путем полимеризации цепной реакции. Он базируется на определении участка ДНК С. diphtheriae, где локализован ген дифтерийного токсина, с помощью специфических праймеров. Метод имеет преимущества перед традиционным определением токсигенности: высокую чувствительность, быстрота получения результатов (4-6 ч), не требует выделения чистой культуры. Но для его проведения необходимы специальная аппаратура, дорогие реактивы и соответствующее помещение, а потому может быть проведен лишь в специализированной лаборатории. Все нетоксигенные штаммы дифтерийных бактерий, выделенные от больных и бактерионосителей, необходимо направлять в Украинский центр госсанэпиднадзора (где есть такая лаборатория) для окончательного определения токсигенных свойств С. diphtheriae.

Определение цистиназы (проба Пизу)

С. diphtheriae, С. ulcerans выделяют фермент цистиназу, псевдодифтерийни бактерии и другие дифтероиды его производят.Выделенную культуру засевают уколом в среду с цистином, разлитое столбиком в узкие пробирки. Цистиназопозитивни бактерии расщепляют цистин с выделением сероводорода, который с уксуснокислым свинцом, входящий в среде, образует сернокислый свинец, в результате чего среда окрашивается в темно-коричневый цвет. С. diphtheriae вызывает не только потемнение среды за ходом укалывания, а образует вокруг него "облако" темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности. Результаты учитывают через 20-24 ч инкубирования в термостате.

Определение уреазы (проба Заксе)

Дифтерийные бактерии этого фермента не образуют. Положительную пробу на уреазу дают лишь некоторые другие виды коринебактерий. Для постановки пробы выделенную культуру сеют в бульон с мочевиной. Уреаза разлагает мочевину, изменяет рН среды, сопровождающееся его покраснением. Если фермент не выделяется, изменения окраски бульона не происходит.

Определение пиразинамидазы

Определение пиразинамидазы проводят путем гидролиза пиразинамида в пиразиновой кислоты и аммония. Для этого в стерильную пробирку вливают 0,25 мл стерильной дистиллированной воды, в которой готовят густую взвесь выделенной культуры, затем вносят одну диагностическую таблетку Rosko 598-21. Инкубируют в течение 4-х часов при 37 ° С, после чего добавляют одну каплю только что приготовленного 5% водного раствора сульфата аммонийного железа. При наличии фермента суспензия приобретает красного или оранжевого цвета. Патогенные коринебактерии не выделяют пиразинамидазу, а следовательно, не изменяют цвета суспензии.

Сахаролитические ферменты

Сахаролитические ферменты определяют путем посева полной петли выделенной культуры в каждую пробирку укороченного пестрого ряда Гисса (глюкоза, сахароза, растворимый крахмал). Результаты учитывают через 24 ч инкубации в термостате. Расщепление крахмала может задерживаться до 48 час.

Определение нитратредуктазы

Определение нитратредуктазы является дополнительным тестом для идентификации С. belfanti и С. ulcerans, которые не образуют этого фермента. В пробирку с бульоном, в который добавляют 0,1% KN03, засевают исследуемую культуру, инкубируют в термостате в течение суток. Обязательном контроле со незасеянными средой. В случае наличия нитратредуктазы при добавлении к засеянного бульона 3-х капель реактива Касаткина возникает красное окрашивание. Среда в контрольной пробирке цвета не меняет.Для идентификации коринебактерий последнее время используют бумажные индикаторные диски с глюкозой, сахарозой, мочевиной и крахмалом из набора "Б" для идентификации энтеробактерий (фирма "ИмБио", г.Нижний Новгород). В 4-х пробирках готовят густую взвесь исследуемой культуры и в каждую из них погружают диск с соответствующим углеводом или иным реактивом. После инкубирования в термостате учет выделения уреазы проводят через 40-120 мин, а определение сахаролитических активности - через 5-24 часов. При наличии уреазы белый диск с мочевиной становится розово-малиновым, при отсутствии - остается белым. Диски с глюкозой и сахарозой при наличии соответствующих ферментов уже через 5-6 ч меняют цвет с красного на желтый. При определении амилазы в пробирку с соответствующим субстратом добавляют индикаторный диск с йодом. Если фермента нет - появляется темно-синюю окраску, если есть - цвет раствора остается без изменений.

Специфическая профилактика и лечение

Вакцинопрофилактика дифтерии проводится при введении дифтерийного анатоксина, полученного при обработке дифтерийного токсина формалином. В нашей стране для вакцинации используют АКДС - адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину. Антитоксическую сыворотку применяют для специфической терапии, а антибиотики - для санации бактерионосителей. Из антибиотиков используют пенициллин, ванкомицин, эритромицин и др.

Инфекционисты в Москве

Рязанцева Марина Александровна 27 отзывов Записаться

Цена: 1700 руб.
Специализации: Гепатология, Инфекционные болезни.

Федосюк Александр Васильевич 58 отзывов Записаться

Цена: 1500 руб. 1350 руб.
Специализации: Гастроэнтерология, Гепатология, Инфекционные болезни.

Мыльцев Андрей Анатольевич 182 отзыва Записаться

Цена: 3500 руб. 2275 руб.
Специализации: Аллергология, Иммунология, Инфекционные болезни.

Инфекционисты в Москве

мы с Вами свяжемся и согласуем время