Энтеровирусы
Семейство пикорнавирусов (pico - маленький, RNA - РНК) включает в себя наиболее просто организованные вирусы, многие из которых патогенны для человека. Они относятся к четырем родам (Enterovirus, Rinovirus, Cardiovirus, Aphtovirus), имеющим ряд общих признаков: мелкие размеры (около 28 нм), положительный РНК-содержащий геном, который функционирует в качестве иРНК и обладает инфекционными свойствами, отсутствием внешней оболочки, кубическим типом симметрии капсида и сходными механизмами репродукции. В основе дифференциации родов лежат антигенные различия, неодинаковая чувствительность к низким значениям рН, разная патогенность для человека и некоторые другие признаки. Энтеровирусы вызывают у людей нейроинфекции и заболевания различных органов и тканей. Кардиовирусы и афтовирусы патогенны преимущественно для животных. К афтовирусам относится вирус ящура. Патогенными для человека являются вирусы полиомиелита, Коксаки группы А и В, ECHO, энтеровирусы серотипов 68-72 и вирус гепатита А. Полагают, что энтеровирусы весьма интенсивно эволюционируют, о чем свидетельствует формирование новых типов возбудителей с необычной локализацией в организме. Например, энтеровирус серотипа 70 поражает конъюнктиву глаза, вызывая острый геморрагический конъюнктивит. Все энтеровирусы близки между собой по своей структуре, химическому составу, резистентности к физическим и химическим факторам и другим свойствам. Наиболее изученным из них является вирус полиомиелита.
Энтеровирусная инфекция
Энтеровирусы человека входят в семью Picornaviridae, которая насчитывает более 70 представителей: 3 серотипа полиовируса, 29 серотипов вирусов Коксаки, 32 серотипа вирусов ECHO и 4 энтеровирусы 68-71-го серотипов. Сюда отнесены также и вирус гепатита А, который часто называют энтеровирусом 72-го серотипа. Для
лабораторной диагностики
энтеровирусных инфекций используют вирусологические, серологические и экспресс-методы. В последнее время резко снизилась заболеваемость полиомиелитом и выросло количество полиомиелитоподибних заболеваний, которые вызывают вирусы Коксаки, ECHO. Итак, вирусологические исследования необходимо проводить одновременно на выявление всех энтеровирусов.
Материал для исследования
Материалом для исследования служат испражнения больных в течение первой недели, смывы из носоглотки не позднее третьего дня, кровь, ликвор, моча не позднее пятого дня, сыворотка крови в первый и 14 дня; в случае смерти - кусочки мозга, внутренних органов, лимфоузлы. Стул берут в пенициллиновые флаконы, эмульгируют в растворе Хэнкса, центрифугируют и добавляют эфир и антибиотики. Смывы из носоглотки получают путем двукратного полоскания горла стерильным физиологическим раствором хлорида натрия, освещают центрифугированием и обрабатывают эфиром и антибиотиками. Среднюю порцию мочи (10 мл) также обрабатывают пенициллином и стрептомицином. Кровь и ликвор используют для вирусологических исследований без предварительной обработки. Секционный материал эмульгируют в стерильных ступках с песком, готовят 20% суспензию в растворе Хэнкса, центрифугируют и добавляют антибиотики
Вирусологические исследования
Выделение и идентификация энтеровирусов является основным методом лабораторной диагностики. Для этого используют различные культуры клеток и лабораторных животных. Обработанный, как выше указано, клинический материал инокуляцию в 2-3 вида перевиваемых и первичных культур клеток. Например, для выделения всех 3-охтипив вируса полиомиелита используют первичные культуры клеток почек обезьян и перевиваемых клетки HeLa, Vero, Нед-2. Вирусы Коксаки В, ECHO успешно выделяют в клетках почечного эпителия обезьян и на многих клетках человеческого происхождения (RH, HeLa, Нер-2 и другие). Выделение вирусов Коксаки А осуществляется на культуре клеток RD. При размножении энтеровирусов в культуре клеток микроскопически обнаруживают цитопатическое действие. Инфицированные клетки сморщиваются, становятся маленькими, круглыми, в их ядрах возникает пикноз. Позже клетки полностью разрушаются и отпадают от стенки флакона. Такие изменения вызывает вирус полиомиелита, большинство серотипов вирусов Коксаки В, ECHO, некоторые серотипы вирусов Коксаки А. В клетках амниона человека, эпителия почек, диплоидных клетках W1-3 8 и RD хорошо репродуцируются вирусы Коксаки А и отдельные серотипы вирусов ECHO. Вирусы Коксаки А и В успешно выделяют из исследуемого материала путем заражения однодневных мышей-сосунков в мозг (0,01 мл), под кожу (0,03 мл) в брюшную полость (0,05 мл). По инфицированными мышами ведут наблюдение в течение 14 дней. При наличии в материале вирусов Коксаки А на 2-5 день у животных появляются возбуждение, тремор, парезы и параличи мышц спины и конечностей. При Коксаки В-инфекции на 4-9 день у новорожденных мышей возникают спастические параличи. Из тканей и органов животных, погибших, готовят вирусвмистку суспензию для дальнейших исследований. При гистологическом исследовании обнаруживают дегенератини изменения в ЦНС, печени, поджелудочной железе и миокарде. Индикацию энтеровирусов проводят также по цитопатическим действием в культуре клеток или бляшкоутворення под агаровым или бентонитовых покрытием, а также за развитием паралича и гибелью животных. Для их идентификации используют иммуноферментный анализ, реакцию торможения гемагглютинации, иммунофлюоресценции и РСК. Реакцию нейтрализации на модели клеток проводят как выше описано. Необходимо учитывать, что при массовой иммунизации детей живой полиомиелитной вакциной возможно выделение вакцинных штаммов. Следовательно, необходимо устанавливать происхождение выделенных вирусов. Обнаружение энтеровирусов и определение видов и серотипов эффективно и скорее можно провести с помощью полимеразной цепной реакции. Серологические исследования. Методом парных сывороток ставят цветную пробу, реакцию нейтрализации с угнетением цитопатического действия, бляшкоутворення, РСК, РНГА с эритроцитарных диагностикумами. Цветную реакцию ранее часто ставили при серологической диагностике полиомиелита. Она базируется на способности вируса подавлять обменные процессы в инфицированных культурах клеток в результате чего сохраняется исходный цвет среды (малиновый). Антитела сыворотки крови больных нейтрализующих вирус и метаболизм клеток продолжается. Это приводит к накоплению кислых продуктов в системе, которые изменяют рН среды и оно приобретает желтый цвет. Приводим схему постановки цветной реакции при серологической диагностике полиомиелита. Результаты реакции учитывают визуально на 5-7 сутки путем сравнения цвета среды в опытных и контрольных пробирках. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, при котором произошло нейтрализация вируса (последняя пробирка с культурой клеток, где среда желтого цвета). Диагностическое значение имеет нарастание титра антител во второй сыворотке не менее, чем в 4 раза по сравнению с первой сывороткой.
Экспресс-методы
Экспресс-методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций не нашли широкого применения из-за особенностей их патогенеза. Возможно использование реакции непрямой гемагглютинации с эритроцитарным полиовирусним диагностикумом и непрямой реакции иммунофлюоресценции. Для постановки последней используют иммунную диагностическую антивидовой сыворотку, истощенную гомологичными клетками крови, амниона, "фибробластами. Такая сыворотка реагирует только с вирусным антигеном, что находится внутри клеток изучаемого материала. В последнее время для экспресс-диагностики используют кариологичний анализ, основанный на выявлении характерных изменений в структуре ядер клеток клинического материала, взятого в первые дни заболевания. Микроскопируют мазки из осадка после центрифугирования смывов из носоглотки и мочи и мазки-отпечатки из органов, взятых при аутопсии. фиксирующие в холодном ацетоне, окрашивают гематоксилином. Специфическим для энтеровирусных инфекций является выявление в препаратах смещение хроматина к периферии ядра и образование ярко-фиолетовых телец, напоминающие полумесяц. Это позволяет дать предварительный ответ о репродукцию энтеровирусов в исследуемом материале. Дифференциацию данных и атенуйованих полиовирусних штаммов осуществляют с помощью ПЦР, ИФА, РН с моноклональными антителами. Для полиовирусов I типа используется бентонитовые тест (вирулентные полиовирусы имеют характеристики Ал -, а авирулентный - +).