Бациллы сибирской язвы

Впервые описаны Полендером в 1849 г. и позднее исследованы Р. Кохом и Л, Пастером.

Морфология и физиология

Возбудитель сибирской язвы - В. anthracis - грамположительные крупные палочки с «обрубленными» концами, располагающиеся длинными цепочками. Во внешней среде образуют споры, сохраняющиеся в почве в течение многих десятилетий. В организме людей и животных образуют белковую капсулу. На твердых средах формируют R-формы колоний. Обладает сахаролитическими и протеолитическими свойствами, разжижает желатину «елочкой», что используется для идентификации данных бактерий.

Антигены

В.anthracis содержит два вида антигенов: групоспецифический соматический полисахаридный и видоспецифический капсульный антигены. Первый термостабилен, не разрушается при кипячении и длительно сохраняется во внешней среде. На этом свойстве основана реакция Асколи, имеющая важное практическое значение. Капсульный антиген в отличие от капсульных антигенов других бактерий является полипептидом, а не полисахаридом. Третий антиген, связанный с белковым токсином, называют протектив-ным, поскольку к нему образуются антитела, обладающие протективными свойствами.

Патогенность и патогенез

К факторам вирулентности В. anthracis относятся прежде всего капсульный полипептид, который участвует в адгезии бактерий на чувствительных клетках макроорганизма, например, энтероцитах кишечника или эпителиоцитах респираторного тракта. Вместе с тем он обладает выраженным антифагоцитарным действием. Протеазы широкого спектра обеспечивают инвазию. Существенную роль в патогенезе всех форм сибирской язвы играет белковый токсин, который характеризуется как протективный антиген, летальный фактор и отечный фактор. О протективной активности свидетельствует выработка антител (антитоксинов). Летальный и отечный факторы по механизму действия можно отнести к цитотоксинам и функциональным блокаторам. В зависимости от входных ворот инфекции различают кожную, легочную и кишечную формы сибирской язвы. При кожной форме возбудитель проникает в глубокие слои дермы на границе подкожной клетчатки, вызывая образование специфического карбункула - очага геморрагическо-некротического воспаления. Возбудитель из места внедрения заносится макрофагами в регионарные лимфатические узлы, в которых развивается воспаление. При кожной форме в 1-2% случаев и значительно чаще при других формах развивается септицемия вследствие генерализации процесса.

Иммунитет

После перенесения сибирской язвы формируется напряженный гуморальный антитоксический иммунитет, в котором существенную роль играют антитела - антитоксины к протективному антигену - белковому токсину. Особое значение в иммунитете имеет Т-зависимая аллергия, проявляющаяся в ГЗТ.

Экология и эпидемиология

Сибирская язва - острая особо опасная инфекция преимущественно сельскохозяйственных животных и людей. По мнению одних ученых естественной средой обитания для сибиреязвенных бацилл является почва, в которой возбудитель размножается и длительное время сохраняется в виде спор. Инфицирование почвы происходит через выделения больных животных и захоронения их трупов. Другие считают, что почва является только хранилищем спор. Возбудитель передается людям через продукты, приготовленные из инфицированного материала, особенно мяса при уходе за больными животными, обработке животного сырья. В ряде случаев заражение происходит через кровососущих насекомых - слепней, мух-жигалок, аэрозольным путем (болезнь старьевщиков), а также при контактах со шкурками и кожей от больных животных. Лабораторная диагностика. Наиболее достоверным является бактериологическое исследование,заканчивающееся выделением чистой культуры возбудителя и ее идентификацией с использованием теста «жемчужного ожерелья», которое появляется на питательном агаре с пенициллином вследствие превращения бактерий в протопласты. Для выявления зараженности сырья (меховых шкурок, кожи и т.д.) используют реакцию термопреципитации Асколи. Для определения зараженных животных используют кожно-аллергическую пробу.

Сибирская язва (злокачественный карбункул)

Сибирская язва - острое особо опасное инфекционное заболевание домашних и диких животных, от которых заражаются и люди путем прямого контакта с больными животными и разнообразной сырьем. Выделяют кожную, легочную и кишечную формы болезни. Возбудитель сибирской язвы - Bacillus anthracis - принадлежит к роду Bacillus семьи Bacillaceae. Род Bacillus объединяет еще несколько видов бацилл, с которыми необходимо дифференцировать выделенные культуры сибиреязвенных палочек. Главные из них - B.cereus, B. anthracoides, В. subtilis, В. megaterium.

Взятие материала и отсылки проб

При проведении лабораторной диагностики сибирской язвы у человека исследуют различные материалы в зависимости от клинической формы заболевания: при кожной форме - содержимое везикул, карбункулов, при кишечно - стул; легочной - мокроты. Кровь исследуют при всех клинических формах. От трупа берут кровь, кусочки паренхиматозных органов. Если немедленно засеять материал от трупа невозможно, крови, пунктатов костного мозга и селезенки на предметных стеклах готовят толстые мазки и высушивают. Все пробы помещают в стеклянные банки, флаконы, пробирки. Высушенные мазки кладут в чашки Петри, обертывают вощаной или пергаментной бумагой, пакет надписывают "Осторожно, мазки нефиксированные!" Весь отобранный материал тщательно укладывают в металлический или деревянный ящик, пломбируют или опечатывают сургучом, на крышке пишут "Верх, осторожно!" Оформляют сопроводительный документ, в котором указывают какой материал, место и время забора, от кого принято, и нарочным немедленно отправляют в специальной (режимной) лаборатории. Вскрытие животных, погибших от сибирской язвы, не проводят, поскольку это способствует споруляции и рассеиванию возбудителя. При необходимости разрешается брать только ухо, его помещают в банку, а место разреза прижигают паяльной лампой или концентрированным раствором карболовой кислоты. Берут также образцы шкур, шерсти, шерсти, щетины. В ряде случаев исследуют пищевые продукты (мясо), воду, почву. Лабораторная диагностика сибирской язвы состоит из нескольких этапов: бактериоскопии мазков, выделения и идентификации чистой культуры возбудителя, постановки биопробы, реакции термокильцепреципитации Асколи, постановки аллергической пробы.

Бактериоскопический метод

Из крови, содержимого везикул, мокроты производится по 4 мазки из каждой пробы, окрашивают их по Граму, Романовскому-Гимзе, сибиреязвенных люминесцентной сывороткой, раствором Ребигера, который одновременно фиксирует и окрашивает препарат. Из разных способов выявления капсул метод Ребигера является простым и найдемонстративнишим. Берут 15-20 г генцианы фиолетового и растворяют в 100 мл 40% формалина. Раствор выдерживают при комнатной температуре несколько часов, затем фильтруют. Нефиксированный мазок окрашивают 15-20 секунд, промывают, высушивают. Тело бацилл окрашивается в темно-фиолетовый, а капсулы - в красно-фиолетовый цвет, по Романовскому-Гимзе - тело клеток приобретает голубоватый, а капсула - светло-розового цвета. При обработке мазка флуоресцентной сывороткой бациллы сибирской язвы под люминесцентным микроскопом выглядят как большие палочки, окруженные ярко светлым зеленоватым ободком. Наличие в мазках типовых бацилл, которые располагаются цепочками, окруженными капсулами, дают специфическую флуоресценцию, обусловливает возможность поставить предварительный диагноз сибирской язвы.

Бактериологическое и биологическое исследование

Окончательный диагноз сибирской язвы можно поставить только после выделения чистой культуры и положительной биопробы на животных. Исследуемый материал сеют в МПБ, чашки с МПА и кровяным агаром. Посевы инкубируют при температуре 37 ° С в течение 18-20 час. Одновременно с посевами эмульгированных исследовательским материалом заражают подкожно лабораторных животных. Белым мышам его вводят у корня хвоста - 0,1 мл, гвинейским свинкам под кожу живота - 0,2 мл, кроликам - 0,5-3,0 мл. В бульоне наблюдается рост в виде пучка ваты, при микроскопии которого видно типичное расположение микробов в виде длинных цепочек (стрептобациллы). На поверхности МПА вырастают крупные шероховатые матовые R-формы колоний с неровным, волокнистым, кудрявым краем ("голова медузы", "львиная грива"). Такие колонии необходимо изучать под малым увеличением микроскопа в проходящем свете. На кровяном агаре колонии имеют S-или SM-форму без гемолиза, в то время как вокруг колоний антракоидив возникает большая зона просветления среды. На МПА и МПБ В. anthracis при обычных аэробных условиях растет без образования капсул, что не позволяет определить одну из важнейших ее признаков. Для выявления капсулоутворення лучшими способами является заражение белых мышей с последующей окраской мазков-отпечатков из органов и посевы на специальный элективный агар Буза (Венгрия) и Тома (Болгария) или на среду, содержащую раствор Хэнкса и 40% стерильной бычьей сыворотки. Посевы выращивают в атмосфере 20-40% С02. На следующий день 2-3 подозрительные колонии после микроскопии отсеивают на скошенный МПА для выделения чистой культуры. Животные погибают через 24-36 ч от острой септицемии, проводят их вскрытие, делают посевы из крови, селезенки и исследуют мазки-отпечатки как выше описано. На 3-й день исследования заражают белых мышей, но уже чистой культурой, проводят дополнительные посевы и выполняют тесты для ее окончательной идентификации и дифференциации от антракоидив и некоторых бацилл почвы. При этом учитывают главные и дополнительные признаки. К основным критериям относят специфическую патогенность, капсулоутворення, тест "жемчужного ожерелья" на среде с пенициллином, лизис специфическим фагом, люминесцентно-серологический тест. Дополнительными признаками являются лецитиназную активность, отсутствие подвижности и гемолиза. Специфическую патогенность определяют введением белым мышам 0,2 мл суспензии культуры. Обнаружение в мазках-отпечатках из органов погибших животных крупных палочек, окруженных капсулой, свидетельствует о наличии у микробов специфической патогенности. При заражении мышей слишком большими дозами культур почвенных бацилл у животных иногда наступает заболевание, но феномен капсулоутворення отсутствует. Тест "жемчужного ожерелья" проводят так. К бульону Хоттингера с лошадиной сывороткой (30%) добавляют пенициллин в количестве 0,5 ЕД / мл и сеют 2 капли молодой выделенной культуры. Через 3 ч роста в термостате производят мазки, окрашивают метиленовым синим и микроскопируют. Сибирской бациллы располагаются в виде цепочек из шаровидных форм, напоминающие бусы из жемчуга. Сапрофитные фунтовые бациллы, нечувствительны к пенициллину, растут как обычно, и в мазках обнаруживают палочковидные цепочки. Для выявления фаголизабельности выделенных штаммов на подсушенный МПА в чашке Петри с расчерченным на квадраты дном бактериологической петлей диаметром 5 мм на каждый квадрат наносят большую каплю 5-6 - часовой культуры. Чашку снова подсушивают 30 минут и затем в центр каждой бляшки культуры петлей диаметром 2 мм наносят маленькую каплю специфического сибиреязвенного бактериофага. Учет результатов проводят через 5-6 ч инкубации при 37 ° С. Если культура относится к В. athracis, в месте нанесения на нее фага видно лизис в виде стерильной пятна. Ни один вид сапрофитных бацилл нечувствителен к действию специфического фага. Быстро идентифицировать выделенную культуру можно с помощью диагностической сибиреязвенных сыворотки, меченной флуоресцеина (родамином). Мазок из капсульной культуры фиксируют метанолом, затем в течение 20 мин обрабатывают люминесцентной сывороткой, промывают буферным раствором, высушивают и микроскопируют под люминесцентным микроскопом. В мазках вокруг клеток с капсулой наблюдается специфическое свечение в виде ярко-зеленых ободков. Теперь чаще используют косвенный вариант РИФ. Отсутствие подвижности выявляют методом надавленные (висячей) капли или посевом уколом в пробирку с полужидким агаром, а отсутствие гемолиза устанавливают после посева на кровяной агар. Пробы на лецитиназой и фосфатазу проводят с помощью общепринятых методик. Так, крупные грамположительные неподвижные палочки с капсулами, растущие в виде характерных R-форм колоний, высокопатогенные для экспериментальных животных, дают тест "жемчужного ожерелья", ярко светятся при обработке сибиреязвенных люминесцентной сывороткой, идентифицируют как В. anthracis. В тех случаях, когда выделить возбудителя из исследуемого материала очень трудно или вообще невозможно (трупы животных, кожа, мех, шерсть, шерсть), а также при контроле животного сырья на некоторых производствах, широко используют очень чувствительную и специфическую реакцию термокильцепреципитации Асколи. Она позволяет обнаруживать в материале даже незначительное количество антигена сибиреязвенных бацилл. Термостабильный антиген из исследуемых материалов экстрагируют кипячением или "холодным" способом. Сначала материал измельчают, затем заливают 10-кратным объемом 0,85% раствора хлорида натрия, кипятят 10-15 мин, фильтруют через асбестовую вату. В некоторых случаях материал заливают тройным объемом 0,5% раствора уксусной кислоты. При этом происходит более полноценное экстрагирования антигена. "Холодный" метод чаще применяют при массовом обследовании кож и другого сырья. Пробы материала стерилизуют в автоклаве, измельчают, заливают 10-кратным объемом изотонического раствора и оставляют при температуре 6-16 ° С на 20-24 ч, фильтруют так же. Во всех случаях антиген должен быть максимально прозрачным. Второй компонент реакции - Преципитирующие сыворотку - получают путем гиперимунизации лошадей вакциной СТИ или убитой культурой В. anthracis. В преципитацийни пробирки вносят 0,2-0,3 мл Преципитирующие сыворотки, а затем осторожно наслаивают 0,3 мл термоекстракту. На границе двух жидкостей образуется через 2-5 мин тонкое кольцо преципитата беловатого цвета (помутнение жидкости). Появление осадка через 10 мин считают неспецифической реакцией. Параллельно ставят несколько контролей: Преципитирующие сыворотка + положительный естракт; Преципитирующие сыворотка + естракт с несибиркового материала; Преципитирующие сыворотка + изотонический раствор; нормальная сыворотка + термоестракт и др.. Первый контроль должен быть всегда положительный, все остальные - отрицательными.

Серологическая диагностика

Серологическая диагностика сибирской язвы проводится редко, преимущественно в тех случаях, когда возбудитель болезни выделить не удается. Для выявления антител в сыворотке крови больных используют такие высокочувствительные методы, как РНГА, ИФА, реакция коаглютинации с протективных сибиреязвенных антигеном.

Аллергический метод

Организм больных и переболевших сибирской язвой человека, а также после вакцинации реагирует местной аллергической реакцией на внутрикожное введение аллергена. Состояние сенсибилизации возникает уже на 4-5 день болезни и сохраняется очень долго. Аллергеном для постановки пробы служит антраксином - белково-полисахаридный комплекс, полученный путем гидролиза вегетативных форм сибиреязвенных бацилл. Препарат вводят внутрикожно на ладонной поверхности предплечья в объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 24 и 48 час. Пробу считают положительной при возникновении гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.

Профилактика и лечение

Для специфической профилактики сибирской язвы используют живую вакцину, полученную отечественными учеными. Специфический противосибиреязвенный иммуноглобулин применяют для поздней профилактики и лечения данного заболевания. Из антибиотиков используют беталактамы, аминогликозиды, тетрациклины и другие препараты.