ВИЧ и ВИЧ-инфекция

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)

В 1981 г. в США у мужчин гомосексуалистов впервые была выявлена новая болезнь, названная синдромом приобретенного иммунодефицита человека (СПИД). В 1982 г. американский исследователь Р. Галло высказал предположение, что причиной развития СПИДа является вирус из семейства ретровирусов. К этому времени Р. Галло и его сотрудники уже выделили два Т-лимфотропных ретровируса человека при использовании разработанной ими техники культивирования Т-лимфоцитов in vitro. Один из них-HTLV-I (Human T-lymphotropic virus type 1) - является возбудителем редкого, но злокачественного Т-лейкоза человека. Второй вирус, обозначенный HTLV-II, также вызывает Т-клеточные лейкозы и лимфомы. В 1983 г. из кусочка ткани увеличенного лимфатического узла больного лимфоаденопатией Л. Монтанье, Ф. Барре-Синусси с группой сотрудников Пастеровского института в Париже выделили еще один ретровирус человека с избирательной тропностью к Т4-лимфоцитам. Дальнейшие исследования показали, что новый ретровирус вызывал деструкцию инфицированных клеток с последующей их гибелью в отличие от вирусов HTLV-I HTLV-II, которые трансформируют Т-клетки, приводя к их бесконтрольной пролиферации. В 1986 г. Международный комитет по таксономии вирусов присвоил новому вирусу название Humanimm unodeficiency virus (HIV) - вирус иммунодефицита человека. С этого времени длительно протекающее инфекционное заболевание человека, вызванное ВИЧ, стали называть ВИЧ-инфекцией, а термин СПИД сохранили для обозначения последней, терминальной стадии этого заболевания. Более 90% случаев инфицирования в мире связанны с вирусом иммунодефицита человека первого типа, который является этиологической причиной глобальной пандемии. Вирус иммунодефицита второго типа (ВИЧ-2) эндемичен для Западной Африки и весьма редко встречается в остальных странах мира. ВИЧ-2 имеет генетическую гомологию с ВИЧ-1 на уровне 50% и вызывает аналогичное заболевание, которое имеет более доброкачественное и продолжительное течение.

Структура и химический состав

По структуре ВИЧ-1 и ВИЧ-2 близки к другим лентивирусам. Вирион ВИЧ имеет сферическую форму 100-200 нм в диаметре. Внешняя оболочка вирионов образована двойным липидным слоем, который заимствован вирионом из мембраны клетки хозяина при завершении цикла репликации и выходе из клетки. В оболочке вирионов находится гликопротеиновый комплекс вируса, состоящий из двух субъединиц (gp41, gpl20) с нековалентной связью между ними. Трансмембранный белок gp41 пронизывает оболочку вируса, второй белок - gp 120 формирует отростки («шипы») на поверхности вирионов. С внутренней стороны липидной оболочки расположен матриксный каркас, образованный белком р17/18. Сердцевина вириона цилиндрической или конусовидной формы, образованна капсидным белком р24. В сердцевине вируса заключены нуклеокапсидный протеин р7/р9, геном вируса - две однонитевые молекулы РНК и три вирусных энзима - обратная транскриптаза, протеаза и интеграза. Геном ВИЧ содержит 104 нуклеотидов и представлен 9. Три структурных гена gag, pol u env кодируют компоненты вирусных частиц: ген gag - внутренние группоспецифические белки ви-риона, входящие в состав сердцевины и капсида (р24, р7/9, р17), ген env - типоспецифические белки, входящие в состав внешней оболочки (gp41 и gpl20), ген pol - белки вирусных энзимов. В геноме ВИЧ имеется также шесть регуляторных генов, кодирующих небольшие протеины, участвующие в системе регуляции деятельности структурных генов. ВИЧ-1 и ВИЧ-2 имеют гены tat, rev, nef, vif, vpr. Кроме того, ВИЧ-1 имеет также ген vpu, а ВИЧ-2 - ген vpx. В пределах общей длины генома гены частично перекрываются с соседними, два гена tat u rev состоят каждый из двух отрезков, довольно далеко отстоящих друг от друга. Tat протеин - трансактиватор транскрипции, необходим для биосинтеза полноразмерного транскрипта вирусной РНК, он увеличивает скорость транскрипции как структурных, так и регуляторных вирусных белков в десятки раз. Rev протеин обеспечивает транспорт из ядра несплайсированной или однократно сплайсированной вирусной РНК в цитоплазму, где с нее транслируются Gag/Pol или Env протеины. В отсутствии продукта гена rev структурные белки вообще не образуются. Важность Nef протеина была очевидна с самого начала его открытия, однако функциональное предназначение продолжает обсуждаться. По одним из последних данных, функция протеинов Nef и Vpu направлена на снижение экспрессии клеточных CD4 рецепторов в инфицированной клетке. Tat, Rev и Nef белки не входят в состав вириона , но являются первыми вирусными компонентами, которые синтезируются в процессе цикла репликации вируса. Отличительной чертой ретровирусов вообще, и ВИЧ в частности, является высокая изменчивость по сравнению с диапазоном изменчивости других вирусов. Именно применительно к ретровирусам было введено понятие квази видов, так как даже в пределах одного организма последующие генерации вируса отличаются от родительских. Вероятность мутации для ВИЧ-1 оценивается как Ю-4-10~5 на цикл репликации. В жизненном цикле ВИЧ точечные мутации могут происходить на стадии обратной транскрипции с геномной РНК на «минус»-цепь ДНК, на этапе синтеза «плюс»-цепи ДНК при возникновении провируса к, наконец, при транскрипции РНК с ДНК провируса. Делеции и вставки тоже возможны, однако вероятную частоту их возникновения оценить сложно. Наиболее высокая изменчивость состава нуклеотидов характерна для гена env. Степень изменчивости неодинакова в разных участках молекулы кодируемого оболочечного белка. В молекулах белков оболочки gpl20 и gp41 картировано более 20 функционально значимых последовательностей (сайтов или эпитопов). С вариабельными участками gpl20 V1-V3 связывают фенотипи-ческие свойства вируса, а также тропность к хемокиновым рецепторам, с гипервариабельным участком V3 - иммунный ответ и возможность вируса «ускользать» от прессинга иммунной системы. Для узнавания рецептора CD4 и связывания с ним важны три разные области gp 120. Когда молекула gpl20 находится в пространственной конфигурации, эти области сближены, образуя полость, соответствующую рецептору CD4. Систематизация генетического разнообразия ВИЧ-1 на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов env и gag была осуществлена по положению различных штаммов на бескорневом филогенетическом дереве. Циркулирующие в разных регионах мира штаммы ВИЧ-1 сгруппированы в две разные группы. К первой большой группе М (major) принадлежит большинство известных эпидемических штаммов. Внутри М группы классифицировано, по крайне мере 10 генетических субтипов, каждый из которых обозначен буквами английского алфавита от А до J. Различие в нуклеотидной последовательности V3 области генов env изолятов, принадлежащих к одному субтипу, составляет 5-15%, в то время как между разными субтипами - 16-30%. Отличия в геномах вирусов от одного пациента в динамике заболевания, как правило, не превышают 5%, а от разных людей 0,5 -0,4%. Большой вклад в изучение эволюции ВИЧ-1 вносят открытые в последние годы рекомбинантные формы вируса, которые явились причиной крупнейшей эпидемии среди гетеросексуальной популяции в Таиланде (Е/А рекомбинант) и локальных эпидемий среди наркоманов в двух провинциях Китая (В/С рекомбинант) и в Калининградской области в России (А/В рекомбинант). Помимо группы М в 1994 г. от пациентов Африканского происхождения была идентифицирована другая небольшая группа высокодивергентных штаммов ВИЧ-1 - группа «О» (англ. Outliner- в стороне). Различия в последовательности нуклеотидов вирусов группы О в целом по сравнению с группой М составляют около 35%, а по гену env - 56%.

Патогенез и иммунитет

В общем плане заболевание, вызываемое ВИЧ, может быть охарактеризовано как иммунодефицитное состояние инфекционной природы, возникающее вследствие способности вируса паразитировать непосредственно в клетках иммунной системы. Практически с такой же частотой, как иммунная, поражается при ВИЧ-инфекции и нервная система. Патогенез ВИЧ-инфекции представляет собой сложный процесс многолетнего взаимодействия возбудителя с организмом хозяина от момента первичной инфекции до последней смертельной стадии заболевания. Заражение человека происходит при попадании вируссодержащих материалов на слизистые гениталий или прямой кишки, непосредственно в кровь, а так же через инфицированную плаценту. Прямыми клетками-«мишенями» для ВИЧ являются клетки, имеющие на своей поверхности CD4 рецепторы, которые более всего представлены на мембране Т-лимфоцитов-хелперов. Многие другие клетки также имеют CD4 рецепторы (моноциты и их тканевые формы - макрофаги, клетки Лангерганса, фолликулярные клетки лимфоузлов, альвеолярные макрофаги легких, клетки микроглии и др.). Однако известно, что ВИЧ также может инфицировать клетки, не имеющие CD4 рецепторы (астроциты, эндотелиальные и эпителиальные клетки). Новейшие исследования по изучению тропности вируса к разнообразным хемокиновым рецепторам, очевидно, внесут дополнительную информацию о механизмах развития ВИЧ-инфекции. Дендритные клетки (особенно клетки Лангерганса при инфицировании слизистых) и моноциты / макрофаги инфицируются одними из первых и через циркуляцию доставляют вирус в кровь и в ближайшие лимфоидные органы, представляя вирус Т4-лимфацитам. При парентеральном заражении вирус может непосредственно инфицировать Т4-лимфоциты. Показано, что вирусы, изолируемые на начальных стадиях заболевания, относятся в основном к макрофаготропным. ВИЧ реплицируется в макрофагах/моноцитах с умеренной интенсивностью и, выходя из клетки, не оказывает на нее цитолитического действия. Эти клетки являются хроническим резервуаром вируса и дополнительным фактором распространения ВИЧ в органах и тканях. В частности, инфицированные макрофаги уже на самых ранних стадиях заболевания преодолевают гематоэнцефалический барьер и переносят вирус в центральную нервную систему и др. органы. На стадии первичной инфекции заражение Т4-лимфоцитов сопровождается взрывным всплеском вирусной репликации (2-3 недели от момента инфицирования). Это способствует дальнейшему распространению вируса в лимфоидных органах (лимфатические узлы, селезенка, миндалины). Количество Т4-лимфоцитов в крови уменьшается, а вирусная нагрузка (количество копий РНК ВИЧ) может достигать 1 млн. Частичное купирование острой ретровирусной инфекции корректируется иммунным ответом организма в основном за счет цитоток-сических лимфоцитов и нейтрализующих антител, выявляемых на 3-12 неделе (сероконверсия). Это сопровождается восстановлением числа Т4-лимфоцитов (но не до исходного уровня) и постепенным снижением уровня репликации вируса (концентрация РНК в периферической крови снижается на 3-5 lg). Обычно к 6-8-му мес. после инфицирования достигается определенное плато (setpoint) в уровне репликации, которое отражает то равновесие, которое достигается между организмом и вирусом и заболевание переходит в стадию бессимптомной хронической инфекции. Количественные параметры этого равновесия, выражаемые количеством Т4-лимфоцитов и уровнем вирусной нагрузки, индивидуальны. Термин «бессимптомная» в названии стадии относится только к клиническим проявлениям. Репликация вируса в пределах плато продолжается, погибшие Т4 клетки еще восполняются адекватным количеством новых. Лимфатические узлы перегружены внеклеточным и внутриклеточным вирусом, что проявляется (но не у всех) персисгирующей генерализованной лимфоаденопатией. Длительность цикла репродукции одной генерации вируса 2,6 дня. Половина новых вирионов погибает каждые 6 ч, но вирусемия поддерживается постоянными, повторными циклами реинфекции и репродукции в продуктивно инфицированных Т4 клетках. Полагают, что каждый день в организме появляется 10 биллионов вирионов, число генераций вируса за год - 140, а за 10 лет более 1400. Рассчитано, что любая мутация в любой позиции генома может происходить много раз в день, а при использовании лекарственных средств может быть генерирован почти любой резистентный мутант. Продолжительность периода клинически бессимптомной инфекции для 80% пациентов составляет 8-12 лет. В конце этого периода равновесие, столь длительно поддерживавшееся иммунной системой, нарушается. Следующая симптоматическая фаза инфекции характеризуется прогрессирующей активизацией репликации вируса, повышением содержания ВИЧ РНК в плазме, а также прогрессирующим усилением деструкции иммунной системы, проявляющимся в снижении количества Т4 клеток и дискоординацией многих других показателей. Клинические симптомы и синдромы нарастают с переходом в тяжелые прогрессирующие болезни, манифестирующие наступление собственно СПИДа. Большинство этих болезней проявляются в таких формах, которые не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой. Эти болезни, которые называются СПИД-индикаторными, включают опухоли, инвазии, грибковые, вирусные и в меньшей степени бактериальные инфекции, вызываемые условно патогенными возбудителями. Механизм дисфункции иммунной системы при ВИЧ-инфекции многообразен. Аномалии клеточного звена, в первую очередь, связаны с Т4-лимфоцитами. Снижение их абсолютного количества определяется не только прямым цитопатическим действием вируса. Один из механизмов состоит в том, что зараженные клетки, продуцирующие gpl20, сливаются со здоровыми клетками, в мембране которых имеется антиген CD4 (образование синцитиев). Точно так же и свободный gpl20, циркулирующий в крови, может связываться с CD4 молекулами неповрежденных клеток, которые распознаются иммунной системой как чужеродные и разрушаются. Предложена гипотеза, согласно которой гибель Т4-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции связана с физиологической гибелью клеток (апоптоз), запускаемой взаимодействием gpl20 с CD4 рецепторами. Существуют и другие механизмы патогенеза ВИЧ, объясняющие гибель Т4-лимфоцитов. Известно, что Т4-лимфоцитам отводится центральная роль в регуляции иммунного ответа, которая осуществляется через систему клеточных медиаторов-цитокинов. При ВИЧ-инфекции нарушается синтез цитокинов, продуцируемых субпопуляциями Т4-лимфоцитов (Тх-1 и Тх-2). Секреция ИЛ-2 и Y-интерферона, участвующих в реализации клеточного иммунитета, непрерывно уменьшается, а ИЛ-4 и ИЛ-10, участвующих в реализации гуморального иммунитета, - повышается. Инфицированные ВИЧ макрофаги претерпевают ультраструктурные изменения, нарушается хемотаксис и Fc-зависимый фагоцитоз. Из-за постоянной активации мононуклеаров наблюдается гиперфункция противовоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-6). В результате нарушений в синтезе цитокинов Т-клеточного и макрофагального происхождения, регулирующих функцию В-лимфоцитов, происходит их поликлональная активация, сопровождающаяся спонтанной продукцией неспецифических иммуноглобулинов. Одной из гипотез о ведущих патологических факторах при ВИЧ-инфекции являются аутоиммунные патологические процессы в связи с перекрестной реактивностью ряда эпитопов вирусных белков и белков организма человека. Это лишь некоторые из множества элементов иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции. В целом можно сказать, что ВИЧ, внедряясь в клетки иммунной системы, или разрушает их с помощью различных механизмов или видоизменяет их функции, инициируя разнонаправленные изменения в синтезе цитокинов, что, в конечном счете, нарушает все звенья иммунитета. Это является той патологической основой, на которой развивается симптомокомплекс СПИДа. В то же время ВИЧ сам подвергается действию иммунной системы, поскольку в организме человека формируется защитный ответ на его внедрение. С самого начала инфекции начинается продукция специфических анти-ВИЧ-антител (сначала Ig M, а далее IgG и IgA), которая сохраняется на протяжении всех стадий болезни с некоторыми изменениями в распределении антител к отдельным белкам ВИЧ. Однако эти антитела в лучшем случае являются лишь свидетелями инфекции, а с помощью ряда механизмов могут ее даже усиливать. Антитела к гликозилированной форме gpl20 обладают вируснейтрализующими свойствами in vitro, но не контролируют развитие уже начавшейся инфекции. Одной из причин является высокий темп репродукции вируса и, как следствие, быстрота вовлечения в патологический процесс все новых клеток. Специфическая антителозависимая клеточная цитотоксичность, осуществляемая моноцитами или нормальными киллерами в присутствии анти-ВИЧ-антител в отношении клеток, на которых экспрессированы антигены ВИЧ, достаточно выражена in vitro, однако защитное значение этого феномена не доказано. Наиболее важным фактором, сдерживающим репликацию ВИЧ, являются Т8 цитотоксические лимфоциты, которые могут непосредственно лизировать вируссодержащие клетки или действовать опосредованно через синтезируемые ими цитотоксины (CD8 антивирусный фактор) и (3-хемокины. Считают, что высокая активность Т8-лимфоцитов является основным фактором длительного сохранения фазы асимптоматической инфекции у ВИЧ-инфицированных долгожителей. В общем итоге ответ на ключевой вопрос патогенеза ВИЧ-инфекции - чем регулируется репликация вируса - состоит в том, что эта роль отводится организму хозяина, которая реализуется через сеть эндогенных цитокинов. Противовоспалительные цитокины, свидетельствующие о хронической иммунной активации (ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-6) усиливают репликацию ВИЧ. В то же время другие цитокины, такие как ИЛ-10, ИЛ-2, ИНФ-Y, CD8 антивирусный фактор, а так же Р-хемокины угнетают экспрессию ВИЧ. Все эти факторы вносят свой вклад в баланс между супрессией и репродукцией вируса, а следовательно, и в течение заболевания. Дополнительную роль играют многочисленные ко-факторы со стороны организма хозяина, вируса, а также сопутствующие оппортунистические инфекции.

Эпидемиология

Источником инфекции является ВИЧ-инфицированный человек на всех стадиях заболевания. Вирус содержится в крови, сперме, влагалищном и цервикальных секретах, в грудном молоке, которые являются факторами передачи инфекции. Предполагается, что инфицирующая доза вируса составляет около 10 тыс. вирионов. Слюна, моча, слезная жидкость также содержат вирус, но количество его недостаточно для заражения. Пути передачи инфекции - половой, парентеральный и вертикальный. С передачей вируса при половых контактах связано около 85-90% всех случаев ВИЧ-инфекции в мире, что позволяет отнести ВИЧ-инфекцию к группе болезней передаваемых половым путем. При этом в глобальном масштабе гетеросексуальные отношения являются причиной 70% случаев заражения, гомосексуальные - 5-10% случаев. 3-5% ВИЧ-инфекции в мире связывают с инфицированием при гемотрансфузиях. Инъекционные наркоманы составляют до 10%, причем эта цифра продолжает увеличиваться. Вертикальная передача ВИЧ от инфицированной матери плоду в последние месяцы беременности, при рождении ребенка или при грудном вскармливании в Африканских странах происходит в 40-50% случаев, а в экономически развитых странах - 25-35%. Эксперты полагают, что интенсивное распространение ВИЧ-инфекции в мире началось в конце 70-х годов, масштабы эпидемии уже более 10 лет расценивают как пандемию. По данным ВОЗ, в конце апреля 1999 г. насчитывалось более 33 млн. людей, инфицированных ВИЧ, и 16,3 млн. погибших от СПИДа. В настоящее время на каждые 100 человек, находящихся в сексуально-активном возрасте (15-49 лет), приходится один носитель ВИЧ. В некоторых регионах СПИД является главной причиной смертности среди взрослого населения. С начала пандемии СПИДа было заражено около 4,8 млн. детей, из которых погибло около 3,6 млн. В Африке, южнее Сахары, проживает две трети зараженных ВИЧ, доминирует гетеросексуальное распространение вируса. В остальных регионах мира картина эпидемического процесса смешанная. Типичной моделью является первоначальная концентрация вируса в группах с рискованным в отношении заражения ВИЧ поведением (гомосексуалисты, внутривенные наркоманы, проститутки) последующим распространением вируса через их половых партнеров в основную популяцию населения. ВИЧ характеризуется сравнительно низкой устойчивостью к воздействию химических и физических факторов. Нагревание при 56° в течение 30 мин. приводит к снижению инфекционного титра вируса в 100-1000 раз, а более высокие температуры быстро и полностью его инактивируют. Вирус быстро погибает под воздействием дезинфицирующих веществ, используемых в лабораторной практике (70% этиловый спирт, 3% р-р перекиси водорода, 5% р-р лизола, 0,2% р-р гипохлорита натрия и др.). ВИЧ в то же время достаточно устойчив при комнатной температуре как в сухой, так и жидкой среде (4-6 дней), а также к Уф облучению и ионизирующей радиации.

ВИЧ-инфекция

Вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ) входят в семьи Retroviridae, рода Lentivirus. Выделяют два вида возбудителей синдрома приобретенного иммунодефицита - ВИЧ-I и ВИЧ-IL ВИЧ-1 имеет округлую форму, его размеры - 100-120 нм. Геном состоит из двух идентичных "плюс"-нитей РНК, ассоциированных с ревертазы и внутренними белками. В геноме содержится 9 генов (3 структурных: gag, pol, env и 6 неструктурных: tat, rev; vift nefy vpr, vpu, кодирующих внутренние белки вируса, ревертазу, эндонуклеазы, протеазу и специфические белки наружной оболочки). Сердцевина вириона окружена белками капсида и приобретает конусообразной формы. С ней ассоциированные белки р7, р9, р24. Она отделена от внешней оболочки еще одним слоем белков - матриксных (р 17) . На внешней липидной оболочке размещены гликопротеиновых транзакции, состоящие из двух субъединиц гликопротеида (gp 41 и gp 120). В совокупности их обозначают как gp 160. В связи с особенностями структуры генома, ВИЧ имеет значительную антигенную изменчивость. При нагревании до 56 ° С в течение ЗО мин вирус инактивируется. Он чувствителен к воздействию спирта, эфира, ацетона, ионизирующего и ультрафиолетового излучения. ВИЧ-2 по своему строению принципиально не отличается от ВИЧ-1, но имеет некоторые отличия в составе генома, белков и т.д.. Диагностика СПИДа - сложная и ответственная. Она базируется на основных клинических проявлениях заболевания, а также результатах вирусологических, серологических и других методов исследования, и требует их комплексной оценки.

Серологическая диагностика

Сегодня в Украине разработана двухэтапная система лабораторной диагностики заболевания, которая включает исследование сыворотки крови человека на наличие антител против ВИЧ. Сыворотка крови лиц с подозрением на ВИЧ-носительство обследуется с помощью ИФА. Это происходит в специализированных лабораториях по диагностике СПИДа, которые разворачиваются на базах СЭС, станций переливания крови, поликлиник, диспансеров, инфекционных больниц и т.д.. Основным материалом для исследования является кровь. ее забирают из локтевой вены в объеме 5 мл. Полученную позднее сыворотку можно хранить при температуре 4 ° С в течение 7 дней. Предлагается также использование образа "сухой капли". Он заключается в том, что с помощью стерильной иглы прокалывают палец и несколько капель крови наносят на стерильную диск, изготовленный из фильтровальной бумаги. Высушенные диски могут храниться длительное время (до 6 месяцев) в полиэтиленовых пакетах. В случае необходимости с помощью фосфатного солевого раствора иммуноглобулины переводят в жидкое состояние и исследуют. Доказано, что антитела против ВИЧ можно обнаружить в слезах, слюне, грудном молоке (IgA), спинномозговой жидкости (у лиц с энцефалопатиями или неврологической симптоматикой), даже в моче. Допустимым считается исследование на наличие антител жидкости стекловидного тела в трупов. ИФА (в основном, косвенный) позволяет определить антитела в любом исследованном материале. Он является достаточно чувствительным методом, который используется в любых лабораториях мира. Антигены для этих тест-систем получают либо из зараженных тканевых культур, или с помощью рекомбинантных ДНК. В Украине используют тест-системы "Антиген", "рекомбинант-ВИЧ", "Служебные-ВИЧ", "Комби-ВИЧ", фирмы "Abbott" и другие. Следует отметить, что антитела в крови появляются не сразу после попадания ВИЧ в организм, а не менее, чем через 2-3 месяца, а порой и дольше (5-8 мес.), Поэтому следует помнить, что ИФА малопригодной для диагностики вирусоносительства именно серонегативный период. Одноразовый положительный результат обнаружения антител в крови не позволяет подтвердить диагноз иммунодефицита. Эту реакцию рекомендуют повторить трижды. Диагностические считаются два Положительных результаты в трех повторах. Такая схема постановки реакций обусловливается тем, что современные тест-системы все же могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Образцы крови, дали два положительных результата из трех повторов, направляются в специализированные лаборатории при научно-исследовательских институтах для подтверждения наличия ВИЧ-вирусоносительства с помощью твердофазного иммуноферментного анализа - вестернблоту или иммуноблота (от англ. Blott - пятно), реакции непрямой имунофлуоресценциии или радиоиммунного преципитации. Эти методы позволяют выявить антитела к определенным вирусных белков. Метод вестернблоту предполагает предварительное Электрофоретическое разделение вирусных белков в полиакриламидном геле с последующим переносом их на специальные нитроцеллюлозные мембраны. После этого на фильтрах разгоняются исследуемые образцы крови с последующей идентификацией их белков (антитела против определенных структурных вирусных белков) с помощью антивидовой меченых сывороток. На нитроцеллюлозные фильтрах появляются цветные полосы, соответствующие комплексам, образованным вирусными структурными белками и антителами сыворотки вирусоносителя. О положительном результате реакции может свидетельствовать наличие антител против вирусных белков р24, РЗИ, gp41, gpl20/160. При отрицательных результатах на фильтрах не видно характерных зон окраски. Одним из эффективных способов определения наличия антител против ВИЧ в крови человека является использование реащии микроагпютинации. Она подобна реакции непрямой гемагглютинации, но вместо эритроцитов, сенсибилизированных соответствующим антигеном, здесь используют как основу частицы желатина или латекса. В случае положительного результата наблюдают за появлением специфического осадка в лунках планшет. Данная реакция дает подобные результаты в ИФА, однако значительно проще по методике постановки, быстрее выполняется, дает меньше ложноположительных результатов. Другим методом выявления антител против ВИЧ является реакция непрямой иммунофлюоресценции. Для постановки этой реакции используют антиген, который получают из перевиваемых линий лимфоцитов, зараженных вирусами иммунодефицита. Из них готовят препараты фиксированных клеток, которые можно хранить в течение 2 месяцев при температуре -20 ° С. В случае необходимости стекла с нанесенным антигеном обрабатывают разбавленными исследуемыми сыворотками (1:10,1:100,1:1000 т.д.), а затем люминесцентной антисывороткой против иммуноглобулинов человека. Препараты дополнительно контрастируют синькой Эванса и изучают в люминесцентном микроскопе. Более чувствительным является метод радиоимунопреципитации. Как и при любой иммунологической реакции в его основе лежит взаимодействие антигенов ВИЧ с антителами против них. В этой реакции как антигены используют белки ВИЧ, меченные радиоактивными изотопами 125И или 35S. Реакцию проводят в жидкой фазе, смешивая гомологичные антигены (вирусные белки gpl20, gp41, р24, р17, р9 и другие) и антитела (сыворотка вирусоносителя), вследствие чего образуются иммунные комплексы. Они взаимодействуют со специальной системой, которая состоит из белка A S. aureus, соединенного с сефароза, вследствие чего происходит преципитация. Образующийся комплекс с помощью ультрацентрифугирования осаждают в пробирках, удаляют надосадочную жидкость, оставляя только субстрат антиген-антитело-белок А-сефароза. На следующем этапе исследования вызывают диссоциацию комплексов додецилсульфатом натрия, подвергают их электрофореза в полиакриламидном геле и с помощью авторадиографии определяют молекулярную массу меченых изотопами белков. Это позволяет установить, какие именно вирусные белки находятся в иммунных комплексах, следовательно, к которым вирусных белков образуются антитела. Этот метод более чувствительным, чем иммуноблот, однако требует специального оборудования, поэтому не используется широко в лабораторной практике. Подытоживая вшцевикладене, можно таким образом подойти к подтверждения диагноза ВИЧ-носительства. Одноразовый отрицательный результат на наличие антител, полученный с помощью ИФА, позволяет сделать вывод об отсутствии ВИЧ-инфицирования. Два положительных результата из трех повторных исследований сывороток не позволяют установить диагноз вирусоносительства. Это можно сделать только после получения положительных результатов о наличии антител против определенных вирусных структурных белков с помощью иммуноблотинга или других методов, его заменяют.

Вирусологическая диагностика

Материалом для исследования может быть кровь, спинномозговая жидкость, грудное молоко, сперма, биоптаты при аутопсии подобное. Для выявления вируса используют электронную микроскопию, заражения культур Т-лимфоцитов (CD4-клетки). Для идентификации вирусов возможно использование высокочувствительных тест-систем ИФА, реакции непрямой иммунофлуоресценции, характерной цитопатического действия подобное. Важным для диагностики СПИДа является определение провируса в лимфоцитах, или вирусных нуклеиновых кислот в патологическом материале. С этой целью широко используются методы молекулярной гибридизации. Использование этого метода приобретает важное значение особенно из-за того, что серонегативный период при СПИДе может длиться несколько месяцев. Высокая чувствительность предлагаемого метода позволяет выявить даже единичные вирусные частицы в крови (0,1-1,0 нг нуклеиновых кислот). Принцип его заключается в том, что в условиях in vitro вызывается процесс гибридизации между вирусной нуклеиновой кислотой (ДНК, РНК) и специальным зондом, который меченый радиоактивным фосфором 32Р. Образующийся комплекс достаточно легко идентифицировать с помощью авторадиографии. Однако использование 32Р-зондов в определенной степени усложняет этот метод, поскольку они имеют короткий (2 недели) период полураспада, требуют соблюдения строгих правил техники безопасности при работе с радиоактивными изотопами подобное. Учитывая это, перспективным направлением является использование зондов, которые можно обнаружить с помощью цветных ферментативных реакций. Такой меткой является биотин (биотиновий зонд). Существуют различные варианты молекулярной гибридизации, среди которых чаще всего применяются точечная гибридизация, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ (в зараженных тканях). Одним из вариантов молекулярной гибридизации рассматривается полимеразно-цепная реакция, в основе которой лежит амплификация генов. Использование ДНК-полимеразы, например, с Thermophylus aquaticus позволяет за несколько циклов амплификации значительно увеличить количество исследуемых нуклеиновых кислот, вследствие чего их можно обнаружить любыми известными методами - ИФА, электрофорез в полиакриламидном геле подобное. Эта реакция существенно превышает чувствительность предыдущего метода (на несколько порядков), поэтому может быть использована при исследовании микрообъемов материала или таких тест-объектов, где другими методами вирусы иммунодефицита не проявляются, например, смывы из носоглотки, слюна. Кроме описанных методов диагностики, допустимым признается выявление антигенемии, которая обусловлена белком р24. Этот р24-антиген можно определить с помощью модифицированных методов ИФА. Получение положительного результата при применении одного из следующих методов является достаточным аргументом для установления этиологического диагноза ВИЧ-инфекции. Вирусологическая диагностика СПИДа - достаточно сложный процесс, доступный для выполнения только в высокоспециализированных лабораториях, где создаются все необходимые условия для работы (защита персонала от заражения во время культивирования, очистки и концентрирования ВИЧ) и являются высококвалифицированные специалисты. Таким образом, при наличии ВИЧ-инфекции у вирусоносителей или больных СПИДом можно обнаружить такие вирусспецифического маркеры: антитела к ВИЧ, непосредственно инфекционный вирус, провирус в ДНК пораженных иммуноцитов, вирусный антиген в сыворотке крови и инфицированных клетках-мишенях.