Диагностика хламидиоза

Взятие материала

Ватным тампоном, смоченным изотоническим раствором натрия хлорида, обрабатывается головка полового члена в области наружного отверстия мочеиспускательного канала. Затем желобоватый зонд вводят в уретру: мужчинам на глубину 2,5-4 см , женщинам на глубину 1-1,5 см , после чего берется соскоб для микроскопического исследования.
При взятии материала из шейки матки вначале ватным тампоном и пинцетом удаляют слизистую пробку, после чего под визуальным контролем ложкой Фолькмана, введенной в канал шейки матки, берут соскоб. В настоящее время для взятия материала используется специальная щеточка (Accelone-Multi-Instrument, AMI). Забор материала рекомендуется брать из указанных мест, так как оптимальным для персистенции и размножения С.trachomatis являются определенные участки цилиндрического эпителия (у мужчин передняя часть уретры на глубине 2,5-4 см, у женщин слизистая канала шейки матки на глубине 1,5 см).
При наличии обильных гнойных выделений диагностика хламидий может представлять определенные трудности . В этих случаях забор патологического материала необходимо проводить после мочеиспускания . Чувствительность диагностики значительно повышается при взятии нескольких соскобов и строгом соблюдении методики забора материала.
Индикация хламидий непосредственно в пораженных клетках - выявляются цитоплазматические включения, которые образуются хламидиями при окрашивании их морфологических структур (антигенов).
Для исследования используется следующий материал: соскобы с слизистых оболочек мочеполовых органов (уретра, шейка матки, канал шейки матки); при экстрагенитальных формах хламидиоза (конъюнктива, прямая кишка и др.); мазки-отпечатки выделений, секретов, биопсированных тканей.
Выявление морфологических структур микроорганизма - мало чувствительный метод обнаружения в эпителиальных клетках включений хламидий при соскобах препаратов, окрашенных по методу Романовского-Гимзы. Цитоплазматические включения выглядят в виде компактных или рыхло расположенных зернистых масс, содержащих на разных этапах развития морфологические структуры возбудителя, определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии, имеют разнообразную форму, отличаются по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы. Мелкие ранние включения, содержащие крупные тельца с средним диаметром 0,5-1,2 мкм имеют сине-фиолетовый цвет, а крупные, в основном содержащие мелкие структуры возбудителя - розово-красный. Нередко в одной эпителиальной клетке выявляются включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности расположения.
Цитологические методы используются для диагностики острых конъюнктивитов у взрослых и новорожденных, в меньшей степени для диагностики хламидийной инфекции мочеполового тракта, так как процент обнаружения при этом колеблется у мужчин в пределах 15-25% случаев, а у женщин 30-40%.

Выявление антигенов микроорганизма методом флуоресцирующих антител (МФА). Сущность МФА заключается в соединении антител, меченных флуорохромом с специфическим антигеном и затем наблюдении продукта распада реакции под люминесцентным микроскопом. Используются меченные флуоресцином моноклональные антитела к липополисахаридам (ЛПС) и основному белку наружной мембраны (МОМР) хламидий. МФА для выявления антигенов хламидий в цитоплазматических включениях может использоваться в прямой и непрямой модификациях.

Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) - предусматривает наличие флуоресцирующей хламидийной антисыворотки.

Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) - сыворотки человека или животного, содержащей хламидийные антитела и соответствующей антивидовой флуоресцирующей сыворотки обычно промышленного выпуска. При люминесцентной микроскопии антигены хламидий выявляются на темном или оранжевом фоне цитоплазмы клеток в виде цитоплазматических включений, флуоресцирующих ярко-зеленым или желтовато-зеленым цветом.

МФА имеет большое диагностическое значение, так как выявляются корпускулярные и растворимые антигены хламидий, является высокочувствительным, специфическим методом диагностики хламидий. Следует отметить, что иммунологические методы, основанные на обнаружении антигенов часто дают ложные результаты (нестандартность выпускаемых наборов, субъективизм оценки, низкая чувствительность при асимптомном и вялотекущем хламидиозе).

Иммуноферментный метод - метод иммуногистохимического выявления антигенов, используемых для индикации антигенов различных микроорганизмов. Имеет сходство с МФА и может применяться в прямой и непрямой постановке. Однако, антигены конъюгируются не с флуорохромом, а с ферментом, для выявления которого необходима гистохимическая реакция. В типичных случаях реакция основана на выявлении хламидийного липополисахарида (ЛПС) с помощью моноклональных или поликлональных антител (AT), сорбированных на твердофазной основе. Пригоден для обслуживания больших географических районов, так как транспортировка образцов может осуществляться в разнообразных условиях и не требует особых затрат. Общая особенность МФА и ИФА в том, что даже после проведенного излечения результаты могут оставаться положительными 1-1,5 мес (пока не сменится слизистая, где находятся разрушенные хламидийные клетки). Так как, моноклональные и поликлональные антитела взаимодействуют с поверхностными антигенными детерминантами хламидий, то в течение этого времени результат анализа будет положительный.

Кожно-аллергическая проба - проводится внутрикожная проба с хламидийным (орнитозным) аллергеном. Аллерген вводится внутрикожно в среднюю треть внутренней поверхности правого предплечья в количестве 0,1 мл, при этом контрольный препарат вводится в левое предплечье. Результаты учитываются через 24 и 48 час. Через 6 час после введения диагностикума появляется красное пятно, которое исчезает через 18 час (контрольное введение). На месте введения специфического аллергена отмечаются красное пятно, инфильтрат, диаметр которого через 24 час составляет от 0,5x0,5 см до 3x4 см. Субъективно иногда отмечается чувство жжения. Реакция оценивается следующим образом: инфильтрат размером 0,5см х 0,5см +; 1см х 1см ++; 2см х Зсм +++ и ++++. Через 48-72 час после появления инфильтрата реакция, как правило, начинает "угасать".

Диагностическое выделение хламидий - проводится в эпителиальных клетках оболочек желточных мешков развивающихся куриных эмбрионов и в культуре клеток. Выделение хламидий в куриных эмбрионах - технически простой метод, но трудоемкий и длительный (от 7-12 дней до 3-4 недель), что ограничивает его практическое применение.
Критерием диагностического выделения хламидий является наличие морфологических структур, содержание родоспецифического антигена.
Выделение хламидий в культурах клеток - наиболее часто используют культуру клеток McCoy, HeLa-229 и L929. Для повышения адсорбции микроорганизма на поверхности клеток и активации поглощения, подавления метаболизма применяется центрифугирование инфекционного материала на монослой клеток, облучение клеток рентгеновскими лучами, обработка монослоя клеток ДЕАЕ-декстраном-поликатионом (5-йод-2-дезоксиуридин, циклогексимид) - антиметаболитами с цитостатическим действием. Результаты оценивают через 48-72 час при исследовании под микроскопом окрашенных культуральных препаратов (выявление в монослое зараженных клеток цитоплазматических включений возбудителя).
Недостатки: чувствительность может оказаться менее 85%; выделение микроорганизма для положительного результата занимает от 3 до 7 дней; так как выявляются только жизнеспособные микроорганизмы, необходимо использовать строгие температурные режимы хранения и специальные транспортные среды; наблюдается несоответствие клинического материала (образцы из уретры мужчин по чувствительности могут быть ниже 50-70%, чем эндоцервикальные образцы); дорогостоящий; проведение возможно в специализированных медицинских центрах.

Обнаружение хламидийных антител.
Проводится с помощью следующих реакций:

• реакция связывания комплемента (РСК);
• реакция непрямой гемагглютинации (РИГА);
• реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

Серологическое обследование проводится неоднократно, с интервалом 10-14 дней. Основанием для постановки диагноза хламидиоза является 4-х кратное повышение в динамике титра хламидийных антител.
Нарастание титра антител при повторном обследовании у здоровых свидетельствует о наличии бессимптомной инфекции.
Недостатки: низкая иммуногенность хламидий; длительная циркуляция антител у переболевших; высокая частотота ложноположительных результатов.

Методы молекулярной биологии - не уступают культуральному методу, превосходят по скорости, не требуют специального оборудования для транспортировки образцов.
Основаны на анализе нуклеотидной последовательности, способности повысить порог чувствительности до 1-10 микроорганизмов С.trachomatis (по сравнению с ИФА - 1000 микроорганизмов).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - основана на обнаружении специфического участка ДНК микроорганизма и позволяет с высокой специфичностью без этапа культивирования детектировать 100 микробных клеток и менее. Принцип метода - повторяющиеся циклы направляемого олигонуклеотидами синтеза ДНК, которые приводят к репликации in vitro нуклеотидных последовательностей мишени. В качестве специфической ДНК-мишени используется нуклеотидная последовательность эндогенной плазмиды длиной 207 пар оснований. Каждое элементарное тельце C.trachomatis содержит 10 копий плазмиды, что ведет к 10-кратному увеличению чувствительности. Тестирование включает 3 этапа: амплификация ДНК-мишени в ПЦР; гибридизация продукта амплификации с специфическим зондом; выявление ам-плифицированной ДНК в одном из вариантов метода ИФА. Кроме повышенной чувствительности, одним из преимуществ является возможность использовать для скрининга не только уретральных и эндоцервикальных образцов, но и также образцов, полученных при неинвазивных процедурах (исследование мочи).
Преимущества: высокая чувствительность и специфичность; отсутствие специальных требований к забору материала; простота транспортировки и хранения; неинвазивность; постановка реакции в полуавтоматическом режиме; быстрое получение результатов; возможность скрининга больших популяций; скрининг мужчин и женщин с бессимптомным течением хламидиоза.

Лигазная цепная реакция (ЛЦР) - основана на лигировании олигонуклеотидов, комплементарных определенной ДНК-мишени. При этом используется способность ДНК-лигазы соединять 2 пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями мишени in vitro. После лигирования 2 олигонуклеотидов продукт реакции, представляющий собой 1 цепочку исходной ДНК-мишени, может в свою очередь служить матрицей для лигирования комплементарных олигонуклеотидов. Затем компоненты реакции подвергаются денатурации нагреванием и проводят гибридизацию с новыми порциями олигонуклеотидов при более низкой температуре. Так как, один из олигонуклеотидов, участвующих в ЛЦР ковалентно связан с гаптеном или лигандом, таким, как например биотин, а другой с репортерной группой, такой, например как щелочная фосфатаза; выявление продуктов реакции может происходить непосредственно после амплификации без использования электрофореза или секвенирования ДНК. Продукт ЛЦР выявляется с помощью анализатора Abbot Lex. Метод может использоваться для анализа уретральных, эндоцервикальных образцов и проб мочи.

Транскрипционная амплификация (ТА) - новый современный метод молекулярной амплификации с помощью транскрипции и гибридизационной защиты для определения рибосомной РНК C.trachomatis в уретральных и цервикальных образцах, пробах мочи у мужчин и женщин. Амплификация специфической рибосомной РНК-мишени происходит с образованием промежуточных ДНК-продуктов. Выявление амплифицированных последовательностей рибосомальной РНК (ампликонов) осуществляется с гибридизацией нуклеиновых кислот. Применяется комплементарный ампликону одноцепочный ДНК-зонд с хеми-люминесцентной меткой. Меченный ДНК-зонд гибридизируется с ампликоном с образованием стабильного РНК-ДНК-гибрида. Отделение гибридов от зондов, не вступивших в реакцию гибридизации, проводится специальным реагентом в люминометре. Чувствительность ТА чрезвычайно высокая (более 99%).

Экспресс методы определения антигена. Экспресс-тест "CHLAMYGEN" является ферментативной системой выявления хламидий. Основан на применении синтетического субстрата, который наряду с специфическим ферментом C.trachomatis претерпевает химическое превращение (развивается пурпурная окраска на кончике аппликатора через 10 мин). Применяется для диагностики образцов, взятых у пациента. Согласно наблюдениям отмечаются низкая специфичность и высокий процент ложно-положительных результатов.