vse-zabolevaniya.ru Запись к врачу в Москве
ГлавнаяСифилисЛабораторная диагностика сифилиса

Лабораторная диагностика сифилиса


Микроскопическое исследование

При первичном сифилисе исследуется на бледную трепонему отделяемое твердого шанкра или пунктат лимфатических узлов. При вторичном сифилисе материал берется с поверхности эрозированных папул на коже, слизистых, с трещин и др. Перед взятием материала с целью очищения от различных загрязнений поверхность очагов (эрозии, язвы, трещины) необходимо тщательно протереть стерильным ватно-марлевым тампоном, который смачивается изотоническим раствором хлорида натрия или назначить примочки с этим же раствором. Очищенную поверхность осушивают сухим тампоном и платиновой петлей или лопаточкой слегка раздражают периферические участки, одновременно слегка сдавливая пальцами в резиновой перчатке основание элемента до появления тканевой жидкости (серума), из которой готовят препарат для исследования. Получение тканевой жидкости имеет важное значение для диагностики сифилиса, так как бледные трепонемы находятся в просветах лимфатических капилляров, в тканевых щелях вокруг лимфатических и кровеносных сосудов.

Пункция регионарных лимфатических узлов

Кожу над лимфатическими узлами обрабатывают 96% спиртом и 3-5% спиртовым раствором йода. Затем 1 и 2 пальцами левой кисти фиксируют лимфатический узел. Правой рукой берут стерильный шприц с несколькими каплями изотонического раствора хлорида натрия, который вкалывается параллельно продольной оси лимфатического узла. Игла проталкивается в разных направлениях до противоположной стенки капсулы узла и содержимое шприца медленно вводится. Пальцами левой кисти лимфатический узел слегка массируется. При медленном извлечении иглы одновременно выдвигают поршень шприца, аспирируя содержимое лимфатического узла. Материал наносится на предметное стекло (при малом количестве материала добавляется капля изотонического раствора хлорида натрия), покрывается покровным стеклом. Исследование нативного препарата проводится в темном поле зрения при помощи светооптического микроскопа с темнопольным конденсором (объектив 40, 7х, 10х или 15х). Бледные трепонемы могут обнаруживаться также в окрашенных препаратах. При окраске по Романовскому-Гимзе бледные трепонемы окрашиваются в розовый цвет, по Фонтану и Морозову в коричневый (черный), по методу Бурри неокрашенные трепонемы выявляются на темном фоне.

Серологическая диагностика

Важное значение в диагностике сифилиса, оценке эффективности лечения, установлении критерия излеченности, выявления скрытых, резистентных форм придается стандартным (классическим) и специфическим серологическим реакциям. К стандартным или классическим серологическим реакциям (КСР) относятся:
  • Реакция Вассермана (РВ),
  • осадочные реакции Кана и Закса-Витебского (цитохолевая),
  • реакция на стекле (экспресс-метод),
к специфическим:
  • реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ),
  • реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Реакция Вассермана (РВ)

- разработана А.Вассерманом (A.Wasserman) совместно с А.Нейссером (A.Neisser) и Ц.Бруком (C.Bruck) в 1906 году. Реакции Вассермана основана на феномене связывания комплемента (реакция Борде-Жангу) и позволяет определять противолипидные антитела (реагины). Согласно современным представлениям, в реакции Вассермана определяются антитела к липидам макроорганизма, а не бледной трепонемы и реакция выявляет аутоиммунный процесс, который вызывается денатурированием бледными трепонемами тканей макроорганизма с образованием липопротеидного комплекса (конъюгата), в котором липиды (гаптены) являются детерминантой.

Обычно РВ ставится с двумя или тремя антигенами. Наиболее часто применяется отличающийся высокой чувствительностью кардиолипиновый антиген (экстракт из сердца быка, обогащенный холестерином и лецитином) и трепонемный антиген (обработанная ультразвуком взвесь анатогенных культуральных бледных трепонем). Совместно с реагинами сыворотки крови больного эти антигены образуют иммунный комплекс, способный адсорбировать и связывать комплемент. Для визуального определения образованного комплекса (реагины + антиген + комплемент) в качестве индикатора применяется гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой). Если комплемент связан в 1 фазе реакции (реагины + антиген + комплемент), гемолиз не наступает - эритроциты выпадают в легко заметный осадок (РВ положительная). Если в 1 фазе комплемент не связан вследствие отсутствия в испытуемой сыворотке реагинов, он будет использован гемолитической системой и произойдет гемолиз (РВ отрицательная). Степень выраженности гемолиза при постановке РВ оценивается плюсами: полное отсутствие гемолиза ++++ или 4+ (РВ резкоположительная); едва начавшийся гемолиз +++ или 3+ (РВ положительная); значительный гемолиз ++ или 2+ (РВ слабоположительная); непонятная картина гемолиза ± (РВ сомнительная); полный гемолиз - (реакция Вассермана отрицательная).

Помимо качественной оценки РВ имеется количественная постановка с различными разведениями сыворотки (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых клинических форм сифилитической инфекции, а также при проведении контроля за эффективностью лечения. В настоящее время реакция Вассермана ставится с двумя антигенами (кардиолипиновый и трепонемный озвученный штамм Рейтера). Как правило, РВ становится положительной на 5-6 неделе после заражения у 25-60% больных, на 7-8 неделе - у 75-96%, на 9-19 неделе - у 100%, хотя в последние годы иногда раньше или позже. При этом, титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимальной величины (1:160-1:320 и выше) в случае появления генерализованных высыпаний (сифилис вторичный свежий). При позитивации РВ выставляется диагноз первичного серопозитивного сифилиса.
При вторичном свежем и вторичном рецидивном сифилисе РВ положительная у 100% больных, но у истощенных больных с ослабленным иммунитетом может наблюдаться отрицательный результат. Впоследствии титр реагинов постепенно понижается и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80-1:120.
При третичном сифилисе РВ положительная у 65-70% больных и обычно наблюдается низкий титр реагинов (1:20-1:40). При поздних формах сифилиса (сифилис внутренних органов, нервной системы) положительная РВ наблюдается в 50-80% случаев. Титр реагинов колеблется от 1:5 до 1:320.
При скрытом сифилисе положительная РВ отмечается у 100% больных. Титр реагинов от 1:80 до 1:640, а при позднем скрытом сифилисе от 1:10 до 1:20. Быстрое снижение титра реагинов (вплоть до полной негативации) во время лечения свидетельствует об эффективности лечения.

Недостатки реакции Вассермана - недостаточная чувствительность (в начальной стадии первичного сифилиса отрицательная). Она негативная также у 1/3 больных, если они в прошлом лечились антибиотиками, у пациентов третичным активным сифилисом с поражениями кожи и слизистых, костно-суставного аппарата, внутренних органов, центральной нервной системы, при позднем врожденном сифилисе.
Недостаточная специфичность - реакция Вассермана может быть положительная у лиц, которые ранее не болели и не болеют сифилисом. В частности ложноположительные (неспецифические) результаты РВ отмечаются у больных, которые страдают системной красной волчанкой, лепрой, малярией, злокачественными новообразованиями, поражениями печени, обширными инфарктами миокарда и другими заболеваниями, а иногда у совершенно здоровых людей.
Кратковременная ложноположительная реакция Вассермана выявляется у некоторых женщин перед родами или после них, у лиц, злоупотребляющих наркотиками, после наркоза, приема алкоголя. Как правило, ложноположительная РВ выражена слабо, чаще с низким титром реагинов (1:5-1:20), положительная (3+) или слабо положительная (2+). При массовых серологических обследованиях частота ложноположительных результатов составляет 0,1-0,15%. Для преодоления недостаточной чувствительности, пользуются постановкой на холоде (реакция Колляра) и одновременно она ставится с другими серологическими реакциями.

Осадочные реакции Кана и Закса-Витебского

Реакция Вассермана применяется в комплексе с двумя осадочными реакциями (Кана и Закса-Витебского), при постановке которых готовятся более концентрированные антигены. Экспресс метод (микрореакция на стекле) - относится к липидным реакциям и основан на реакции преципитации. Ставится со специфическим кардиолипиновым антигеном, 1 каплю которого смешивают с 2-3 каплями исследуемой сыворотки крови в лунках специальной стеклянной пластины.
Преимущество - быстрота получения ответа (через 30-40 мин). Результаты оцениваются по количеству выпавшего осадка и величины хлопьев. Выраженность определяют как КСР - 4+, 3+, 2+ и отрицательная. Следует отметить, что ложноположительные результаты наблюдаются чаще, чем при РВ. Как правило, экспресс-метод применяется при массовых обследованиях на сифилис, при обследовании в клинико-диагностических лабораториях, соматических отделениях и больницах. На основании результатов экспресс-метода диагноз сифилиса выставлять запрещается, исключается его применение у беременных, доноров, а также для контроля после лечения.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) - предложена в 1949 году Р.Нельсоном (R.W.Nelson) и М.Мейером (M.Mayer). Является наиболее специфичным диагностическим тестом на сифилис. Однако сложность и дороговизна постановки ограничивает ее применение. В сыворотке крови больных производится определение видеоспецифичных антител (иммобилизинов), которые приводят к неподвижности бледных трепонем в присутствии комплемента. Антигеном являются живые патогенные бледные трепонемы, выделяемые от зараженных сифилисом кроликов. С помощью микроскопа проводится посчет утративших подвижность (иммобилизованных) бледных трепонем и оцениваются результаты РИБТ: иммобилизация бледных трепонем от 51 до 100% - положительная; от 31 до 50% - слабо положительная; от 21 до 30% - сомнительная; от 0 до 20% - отрицательная.
РИБТ имеет значение при дифференциальной диагностике для отграничения ложноположительных серологических реакций от реакций, обусловленных сифилисом. Поздно становится положительной чем РВ, РИФ и поэтому для диагностики заразных форм сифилиса ее не применяют, хотя во вторичном периоде сифилиса она положительная у 85-100% больных.
В третичном периоде сифилиса с поражением внутренних органов, опорно-двигательного аппарата, нервной системы РИБТ положительная в 98-100% случаев (РВ часто отрицательная).
Необходимо помнить, что РИБТ может оказаться ложноположительной в случае наличия в исследуемой сыворотке трепонемоцидных препаратов (пенициллин, тетрациклин, макролиты и др.), которые вызывают неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем. С этой целью кровь на РИБТ исследуется не ранее 2 недель после окончания приема антибиотиков и других лекарственных средств.
РИБТ как и РИФ в процессе лечения медленно негативируются, поэтому она не применяется в качестве контроля в процессе лечения.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - разработана в 1954 году A.Coons и впервые применена для диагностики сифилитической инфекции Deacon, Falcone, Harris в 1957 году. РИФ основана на непрямом методе определения флюоресцирующих антител. Антигеном для постановки являются фиксированные на предметных стеклах тканевые патогенные бледные трепонемы, на которые наносят исследуемую сыворотку. Если в исследуемой сыворотке имеются противотрепонемные антитела, относящиеся к IgM и IgG, они прочно связываются с антигеном - трепонемами, что выявляется в люминесцентном микроскопе с помощью антивидовой ("противочеловеческой") флюоресцирующей сыворотки.
Результаты РИФ учитываются по интенсивности свечения бледных трепонем в препарате (желто-зеленое свечение). При отсутствии противотрепонемных антител в сыворотке, бледные трепонемы не определяются. При наличии антител выявляется свечение бледных трепонем, степень которого выражается в плюсах: 0 и 1+ - отрицательная реакция; от 2+ до 4+ - положительная.
РИФ относится к групповым трепонемным реакциям и ставится в разведении исследуемой сыворотки в 10 и 200 раз (РИФ-10 и РИФ-200). РИФ-10 считается более чувствительной, однако часто выпадают неспецифические положительные результаты, чем при постановке РИФ-200 (отличается более высокой специфичностью). Как правило, РИФ становится положительной раньше, чем РВ - положительная при первичном серонегативном сифилисе у 80% больных, у 100% во вторичном периоде сифилиса, всегда положительная при скрытом сифилисе и в 95-100% случаев при поздних формах и врожденном сифилисе.
Специфичность РИФ повышается после предварительной обработки исследуемой сыворотки сорбентом-ультраозвученным трепонемным антигеном, который связывает групповые антитела (РИФ - абс).
Показания к постановке РИБТ и РИФ - диагностика скрытого сифилиса для подтверждения специфичности комплекса липидных реакций в случае предположения сифилитической инфекции на основании положительной РВ. Положительные РИБТ и РИФ являются доказательством латентного сифилиса. При ложноположительной РВ при различных болезнях (системная красная волчанка, злокачественные новообразования и др.) и если повторные результаты РИБТ и РИФ отрицательные, это свидетельствует о неспецифическом характере РВ. Подозрение на поздние сифилитические поражения внутренних органов, опорно-двигательного аппарата, нервной системы при наличии у больных отрицательной РВ. Подозрение на первичный серонегативный сифилис, когда у пациентов при многократных исследованиях отделяемого с поверхности эрозии (язвы), при пунктате из увеличенных регионарных лимфатических узлов бледная трепонема не обнаруживается - в этом случае ставится только РИФ - 10.
При обследовании лиц с отрицательной РВ, которые имели длительные половые и бытовые контакты с больными сифилисом, учитывая вероятную возможность лечения их в недавнем прошлом противосифилитическими препаратами, вызвавшими негативацию РВ. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - метод разработан E.Engvall и соавт., S.Avrames (1971). Сущность состоит в соединении сифилитического антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя с антителом исследуемой сыворотки крови и выявлении специфического комплекса антиген-антитело при помощи меченной ферментом антивидовой иммунной сыворотки крови. Это позволяет оценивать результаты ИФА визуально по степени изменения окраски субстрата под действием фермента, входящего в состав конъюгата. Недостоверные результаты ИФА могут возникать в результате недостаточного разведения инградиентов, нарушения температурного и временного режимов, несоответствии рН растворов, загрязнении лабораторной посуды, неправильной технике промывки носителя.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Предложена в качестве диагностического теста на сифилис T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). Макромодификация реакции называется ТРНА, микромодификация - МНА-ТР, автоматизированный вариант - AMNA-TR, реакция с макрокапсулами из полимочевины вместо эритроцитов - МСА-ТР. Чувствительность и специфичность РПГА аналогичны РИБТ, РИФ, но РПГА имеет меньшую чувствительность при ранних формах сифилиса по сравнению с РИФ-абс и большую при поздних, при врожденном сифилисе. РПГА ставится в качественном и количественном вариантах.

Техника взятия крови для серологических реакций

Для исследования на РВ, РИФ, РИБТ кровь берут из локтевой вены натощак или не раньше 4 час после приема пищи стерильным шприцом или одной иглой (самотеком). В месте взятия кожу предварительно обрабатывают 70% спиртом. Шприц и игла должны быть промыты изотоническим раствором хлорида натрия. В чистую сухую холодную пробирку вливают 5-7 мл исследуемой крови. На пробирку клеится чистая бумага с фамилией, инициалами пациента, номером истории болезни или амбулаторной карты, датой взятия крови. После взятия крови пробирка помещается в холодильник с температурным режимом +4°+8°С до следующего дня. На следующий день сыворотка сливается для исследования. В случае не использования крови на следующий день, сыворотку необходимо слить со сгустка и хранить в холодильнике не более 1 недели. Для исследования на РИБТ пробирка должна быть специально подготовлена и стерильна. В случае нарушения правил забора крови на исследование, несоблюдение условий может произойти искажение результатов.
Не рекомендуется производить забор крови для исследования после приема пищи, алкоголя, различных медикаментозных препаратов, после введения различных вакцин, во время менструального цикла у женщин.
Для исследования на экспресс-метод кровь берегся из кончика пальца, как это делается при ее взятии на СОЭ, но берут кровь на 1 капилляр больше. Экспресс-метод можно также ставить с сывороткой крови, полученной при помощи венопункции. Если возникает необходимость исследования крови в отдаленных лабораториях, вместо крови можно пересылать сухую сыворотку (метод сухой капли). Для этого на следующий день после взятия крови, сыворотку отделяют от сгустка и набирают в стерильный шприц в количестве 1 мл. Затем сыворотку выливают в виде 2 отдельных кружков на полоску плотной писчей бумаги (вощаная бумага или целлофан) размером 6x8 см. На свободном крае бумаги пишется фамилия, инициалы обследуемого и дата забора крови. Бумагу с сывороткой защищают от прямых солнечных лучей и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Сыворотка засыхает в виде небольших кружочков блестящей желтоватой стекловидной пленки. После этого, полоски бумаги с высушенной сывороткой свертывают как аптечный порошок и отсылают в лабораторию, указывая диагноз и с какой целью исследуется.

Серологическая резистентность

У части (2% и более) больных сифилисом, несмотря на проведенную полноценную противосифилитическую терапию, наблюдается замедление (отсутствие) негативации серологических реакций после окончания лечения до 12 мес и более. Возникает так называемая серологическая резистентность, которая в последние годы стала часто наблюдаться. Различают формы серологической резистентности:
  • Истинная (абсолютная, безусловная) - необходимо провести дополнительное противосифилитическое лечение, комбинируя с неспецифической терапией для повышения иммунных сил организма.
  • Относительная - после полноценного лечения бледные трепонемы образуют цист- или L-формы, которые находятся в организме в маловирулентном состоянии и вследствие этого дополнительное лечение не изменяет показатели серологических реакций, особенно РИФ и РИБТ.
В то же время в цист-формах происходят незначительные обменные процессы, а оболочки цист-форм являются чужеродным белком (антигеном). Для своей защиты организм вырабатывает специфические антнтела, которые положительны или резко положительны при постановке серологических реакций, отсутствии проявлений заболевания. При L-формах обменные процессы более снижены и антигенные свойства отсутствуют или незначительно выражены. Специфические антитела не вырабатываются или они в небольшом количестве, серологические реакции слабо положительные или отрицательные. Чем больший период времени от момента заражения, тем большее количество бледных трепонем трансформируется в формы выживания (цисты, споры, L-формы, зерна), при которых противосифилитическая терапия не эффективна.

Псевдорезистентность - после проведенного лечения несмотря на положительные серологические реакции бледная трепонема в организме отсутствует. Антигена в организме нет, но продолжается выработка антител, которые фиксируются при постановке серологических реакций.
Серологическая резистентность может развиваться вследствие:

  • неполноценного лечения без учета давности и стадии заболевания;
  • недостаточной дозы и в частности из-за неучета массы тела пациентов;
  • нарушения интервала между введением препаратов;
  • сохранения в организме бледных трепонем несмотря на проведенное полноценное специфическое лечение, из-за их стойкости к пенициллину и другим химиопрепаратам в случае наличия скрытых, осумкованных очагов поражения во внутренних органах, нервной системе, лимфатических узлах, которые малодоступны для антибактериальных препаратов (нередко бледные трепонемы обнаруживаются в тканях рубца через много лет после окончания терапии, в лимфатических узлах иногда удается обнаружить бледные трепонемы через 3-5 лет после противосифилитической терапии);
  • снижения защитных сил при различных заболеваниях и интоксикациях (эндокринопатии, алкоголизм, наркомания и др.);
  • общего истощения (приемом пищи бедной витаминами, белками, жирами).
Кроме этого, нередко выявляется ложная позитивация серологических реакций, не связанная с наличие у больных сифилиса и вызванная:
  • сопутствующими неспецифическими заболеваниями внутренних органов, нарушениями сердечнососудистой системы, ревматизмом, дисфункциями эндокринной и нервной систем, тяжелыми хроническими дерматозами, злокачественными новообразованиями;
  • поражениями нервной системы (тяжелые травмы, сотрясение головного мозга, психические травмы);
  • беременностью; хроническими интоксикациями алкоголем, никотином наркотиками; инфекционными болезнями (малярия, туберкулез, вирусный гепатит, дизентерия, сыпной, брюшной и возвратный тифы).
Указанные факторы могут оказывать влияние на иммунологическую реактивность организма как в период активного развития сифилитических проявлений, так и во время их регресса.