Бруцеллы
Названы в честь Д. Брюса. Патогенными для человека являются три вида бруцелл: В. melitensis - возбудитель бруцеллеза мелкого рогатого скота, В. abortus - возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота, В. suis - возбудитель бруцеллеза свиней. Все три вида бруцелл патогенны для человека.
Морфология и физиология
Бруцеллы - мелкие коккобактериальные грамотрицательные бактерии. Они не образуют спор, лишены жгутиков и имеют капсулу. Бруцеллы требовательны к питательным средам. Они нуждаются в нативном белке или в аминокислотах и других факторах роста. Размножаются медленно, особенно в первых генерациях.
Патогенность и патогенез
Факторами вирулентности бруцелл являются капсула, способность к инвазии, устойчивость к бактерицидному действию крови, секреция ферментов (гиалуронидаза и др.), которые способствуют их распространению в тканях. Бруцеллы множественными путями проникают в организм хозяина. Затем благодаря выраженной инвазивности попадают в лимфу и кровь, вызывая бактериемию. С кровью они разносятся по организму, проникают и размножаются в лимфоидных клетках, образуя гранулемы в печени, селезенке, лимфоузлах. Высокая инвазивность бруцелл, вероятно, связана с гиалуронидазой и другими ферментами. При разрушении бруцелл освобождается эндотоксин, вызывая присущие ему патологические явления. Хронический метастатический характер бруцеллезной инфекции проявляется поражением кроветворной, нервной, половой системы. У беременных возникают инфекционные аборты. Бруцеллы способны персистировать в лимфоидной ткани в течение длительных сроков. Периодические обострения инфекции связаны с их размножением и поступлением в кровь. Однако в крови бруцеллы не размножаются.
Иммунитет
При бруцеллезе формируется напряженный гуморальный и клеточный постинфекционный иммунитет. Первый проявляется в антителообразовании: в сыворотке крови накапливаются агглютинины (вначале IgM, затем IgG) и опсонизирующие антитела, обладающие протективными свойствами. Клеточный иммунитет проявляется в аллергии замедленного типа (ГЗТ), которая выявляется с помощью кожно-аллергической пробы с бруцеллином, а также в реакции бласттрансформации лимфоцитов и торможении миграции макрофагов. Повторные заболевания практически не встречаются.
Экология и эпидемиология
Бруцеллез является типично зооноз-ной инфекцией. Человек заражается только от больных животных через мясо, молоко, брынзу, масло. Во многих случаях заболевание носит профессиональный характер, поскольку наиболее часто болеют люди, работающие со скотом. Бруцеллы устойчивы к факторам окружающей среды. Они месяцами сохраняются в моче, навозе больных животных, в шерсти овец, в пыли. Хорошо переносят низкие температуры: в замороженном мясе сохраняются до полугода. Высокочувствительны к дезинфектантам и повышенным температурам.
Бруцеллез
Бруцеллез - хроническая или остро-хроническое зоонозная инфекционная болезнь с рецидивирующим долговременным течением, ундулюючою лихорадкой, преимущественным поражением опорно-двигательных органов, нервной и мочеполовой системы. Возбудителями его являются несколько видов бактерий, объединенных в род Brucella: B.melitensisy В.abortus, B.suis, B.ovis, B.canis, B.neotomae. Из всех видов наиболее патогенной для человека B.melitensis. Она вызывает 95-97% всех случаев бруцеллеза, на долю В. abortus приходится 1-3%, еще реже заболевание вызывает B.suis (менее 1%). Позже от баранов, больных эпидидимит, выделили В. ovis, от кустарниковых крыс - B.neotomae, от гончих собак B.canis. Брецели имеют хорошо выраженные антигенные свойства. Они содержат поверхностный Vi-антиген и видоспецифические соматические А и М, количественное соотношение которых неодинаково у разных видов. В B.melitensis преобладает М-антиген, в В.abortus и B.suis - антиген А. Для идентификации бруцелл используют монорецепторными сыворотки. Основными носителями бруцелл являются козы, овцы (B.melitensis), крупный рогатый болезнь (B.abortus), свиньи (B.suis) и северные олени (B.rangiferis). От больных животных возбудитель выделяется с молоком, мочой, испражнениями и особенно с околоплодными водами во время окотов и отелей. Человек заражается от животных контактно-бытовым путем или через сырое молоко и молочные продукты. Заболевание носит профессиональный характер. Чаще болеют пастухи, доярки, ветеринарные работники, скотоводы.
Лабораторную диагностику
бруцеллеза проводят с помощью бактериологических и серологических исследований, биологической и аллергической пробы, а также метода ДНК / ДНК гибридизации. Материалом для исследования может быть кровь, костный мозг, фекалии, желчь, моча, ликвор, мокрота, пунктат лимфатических узлов, у животных - выкидыши, околоплодные воды, а также молоко и молочные продукты. В связи с частыми лабораторными заражениями бруцеллезом выделения чистых культур и заражения гвинейских свинок позволяют проводить только в специальных режимных отделах санэпидемстанции. Серологические исследования выполняют в обычных бактериологических лабораториях.
Бактериологическое исследование
Для выделения гемокультуры из локтевой вены берут 10-20 мл крови и поровну засевают в два флакона с печеночным, сывороточным декстрозных бульоном или МПБ с глюкозой, глицерином и антифаговою сывороткой для подавления бруцеллезного бактериофага. Один флакон инкубируют в обычных аэробных условиях, второй - в атмосфере 10% С02 (для роста В. abortus). Особенностью бруцелл очень медленный рост на средах при выделении от больных, поэтому посевы следует выдерживать в термостате до 4-5 недель, делая висел на элективные Агари каждые 4-5 дней. Наилучшей средой для выращивания бруцелл является сывороточный декстрозных агар (МПА, 5% сыворотки, 1% декстрозы). Для ускорения исследования посевы крови проводят в два прямоугольных флаконы по методу Кастанеды. Флаконы содержат, кроме бульона, еще и слой агара на одной или обеих стенках. Начиная с 4-го дня после посева, флаконы периодически покачивают для того, чтобы оросить бульоном поверхность агара. В случае положительного результата на агаре вырастают колонии бруцелл, которые отсеивают на элективные среды и проводят идентификацию. Если в течение месяца колонии не растут, делают высев из бульона на плотную среду. Получение гемокультуры является одним из основных методов бактериологической диагностики бруцеллеза у людей. Если болезнь вызывает В. melitensis, гемокультура высевается в 65-90% случаев, при заражении В. abortus - в 5-15%. Иногда гемокультура вырастает уже с первых дней лихорадки. Хорошие результаты в острой и хронической стадиях болезни дают посевы пунктатов костного мозга. Миелокультуру удается выделить в 2 раза чаще, чем гемокультуру. Несколько капель аспирата костного мозга засевают в две пробирки с тем же средой. Мочу для выделения уринокультуры и желчь для выделения биликультуры, а также молоко сначала центрифугируют. Из осадка или сливок делают высев по 0,1 -0,2 мл на чашки с агаром "Д", (или печеночным), к которому добавляют генциановый фиолетовый в разведении 1:200 тыс. для задержания роста сопутствующей микрофлоры. Очень эффективны посевы материала в желток куриных жировых (неоплодотворенных) яиц или в желточный мешок куриного эмбриона. Кровь больного или аспират костного мозга разводят бульоном 1:3 и по 0,1-0,2 мл инокуляцию в несколько яиц. Зараженные яйца инкубируют при 37 ° С 5 дней и по 0,5 мл их содержания высевают на жидкие и плотные среды. Рост бруцелл наблюдается уже через 2-3 дня. Если посевной материал (фекалии, моча, мокрота, гной и т.д.) контаминови посторонними микробами, его сначала центрифугируют, осадок разводят генциановый фиолетовым в 3-5 раз и по 0,2 мл вносят в яйца или эмбрионы с последующим посевом на элективные агар. Колонии бруцелл на агаре мелкие (0,1-0,5 мм), круглые, выпуклые, гомогенные с перламутровым оттенком. Бруцеллы могут образовывать как S-, так и R-формы колоний (особенно В. ovis, В. suis и В. canis). С помутневшего бульона и типичных колоний изготовляют мазки, окрашивают по Граму и отсеивают на скошенный агар для выделения чистой культуры. Идентификация культур проводится по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам и на основе реакции агглютинации видовыми и монорецепторными сыворотками. Теперь есть надежные тесты для дифференциации основных видов и биовары бруцелл.
Биологическая проба
Наиболее чувствительными лабораторными животными является гвинейские свинки и белые мыши. До заражения животных прибегают тогда, когда исследуемый материал сильно загрязнен посторонней микрофлорой и высеять из него чистую культуру трудно. Кровь больных, ликвор, экссудат из суставов вводят в брюшную полость (гвинейским свинкам 2-3 мл, мышам - 0,5-1,0 мл). Осадок мочи, околоплодных вод, молока вводят подкожно в паховой области. Через 20-30 дней после заражения проводят вскрытие животных, сеют кровь из сердца и эмульгированные паренхиматозные органы и лимфатические узлы на жидкие и плотные элективные среды. Перед посевом у свинок берут кровь из сердца для постановки реакции агглютинации с целью выявления антител. Положительной биопробу считают тогда, когда выделяют бруцеллы любого вида, или при положительной реакции агглютинации в разведении сыворотки 1:20 и более. Для выявления бруцеллезной антигенов в сыворотке крови, которые могут быть свободными или в виде циркулирующих иммунных комплексов, применяют РНГА при использовании эритроцитарных диагностикумов с моноклональными антителами к родоспецифичних антигенов бруцелл. Используют также реакцию коаглютинации и преципитации, а также метод иммуноферментного анализа.
Серологические исследования
Серологические исследования при бруцеллезе включают реакцию агглютинации Райта, ускоренные пластинчатые реакции на стекле: Хеддлсона, рас-бенгал, латексагглютинации, непрямую реакцию гемолиза. С объемных серологических реакций используют РСК, реакции Кумбса (для выявления неполных антител), РНГА, ИФА, РИФ, опсонофагоцитарну пробу. Из них чаще всего используют реакции Райта, Хеддлсона и РНГА.
Реакция Райта
Реакция Райта - один из основных официальных методов диагностики бруцеллеза во всех странах. Она проста по технике постановки, весьма чувствительна и специфична, оказывается в начале заболевания, достигает диагностического титра на второй неделе и сохраняется положительной в течение 1-4-х лет. Следовательно, ее можно использовать как для диагностики острого периода болезни, так и для установления ретроспективного диагноза. Реакцию ставят по классической схеме в пробирках методом одинаковых объемов. Примечание: КС - контроль сыворотки, КД - контроль диагностикума. Сыворотку больного и диагностикум разводят изотоническим раствором хлорида натрия, к которому заранее добавляют 0,5% фенола (карболизований изотонический раствор). При постановке реакции Райта и Хеддлсона используют единый бруцеллезной диагностикум, который является 10 млрд взвесью убитых нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных анилиновых красителей в синий цвет. Перед постановкой реакции его разводят в 10 раз. Пробирки встряхивают и ставят в термостат на 18-20 ч, затем еще выдерживают 2 часа при комнатной температуре и учитывают результаты обычным способом или по 50% агглютинации (2 +). Серийные разведения 50% агглютинации 1:50, 1:100-1:800 свидетельствует о том, что 1 мл сыворотки больного содержит соответственно 50, 100 ... 800 МЕ антител. Интенсивность реакции оценивают по следующей схеме: 50 МЕ-реакция сомнительная, 100-200 МЕ - положительная, 400-800 МЕ - резко положительная. Реакция Райта может быть положительной у переболевших ранее и у привитых лиц, поэтому с развитием болезни ее ставят повторно и учитывают нарастание титра антител. Часто используют микрометод реакции агглютинации на стекле - пластинчатую реакцию Хеддлсона, особенно при массовых обследованиях на бруцеллез. Для этого хорошо обезжиренную стеклянную пластину 8x12 см разделяют восковым карандашом на 6 одинаковых квадратов. Неразведенную сыворотку больного и бруцеллезной диагностикум наносят с помощью пипеток согласно схеме. Капли сыворотки и антигена смешивают осторожным покачиванием пластины или стеклянной палочкой, слегка подогревают над пламенем газовой горелки. Максимальный срок наблюдения 8 мин. При положительной реакции в смешанных каплях появляются хлопья, а жидкость становится более-менее прозрачной. Агглютинация во всех 4-х квадратах оценивается как резко положительная, в 3-й и 4-й дозах - положительная, во 2-й дозе - слабо положительная - и только в дозе 0,8 мл - сомнительна. Отсутствие агглютинации со всеми дозами сывороток оценивают как отрицательную реакцию. Для ускоренной диагностики бруцеллеза используют также реакцию агглютинации бенгальского розового с кислым антигеном. Антиген готовят из густой взвеси бруцелл, убитых нагреванием, с использованием буферного раствора (рН 3,6 - 3,8) и красителя бенгальского розового. На стеклянную пластинку наносят 0,03 мл неразведенной сыворотки и 0,03 мл антигена, смешивают их круговым движением стеклянной палочки. Результат реакции учитывают через 4 мин. Появление крупно-или мелкозернистой аглютинату свидетельствует о положительной реакции. Реакция связывания комплемента относится по обычной схеме. Она становится положительной с 20-25-го дня заболевания и долго хранится. Постановку опсоно-фагоцитарной пробы последнее время проводят редко. Зато стали широко использовать РНГА.
Реакция непрямой гемагглютинации
Реакция непрямой гемагглютинации при бруцеллезе является специфической и высокочувствительной. Для ее проведения используют эритроцитарный бруцеллезной полисахаридный диагностикум. Чаще РНГА ставят в полистирилових прозрачных планшетах с лунками (можно и в пробирках). Исследуемую сыворотку (а также заведомо положительную и отрицательную для контроля) инактивируют при температуре 56 ° С в течение 30 мин. Для ее серийного разведения используют нормальную сыворотку кролика, предварительно разведенную 1:100. Реакцию ставят по такой схеме. Реакция наступает через 1-2 ч при комнатной температуре. Учет ее проводят через 2 часа. Если гемагглютинация наступает с разведением сыворотки 1:50 - реакция сомнительная; 1:100 и выше - положительная. Реакция Кумбса при бруцеллезе также специфическая и высокочувствительная. Она является ценным диагностическим тестом особенно при хронических формах заболевания у людей и животных.
Аллергическая проба Бюрне
Аллергическая проба Бюрне используется, для диагностики бруцеллеза, особенно при отрицательных бактериологических и серологических исследованиях. Пробу ставят, начиная с 15-20-го дня заболевания. В средней трети предплечья вводят внутрикожно 0,1 мл бруцелину (меллитин, абортину). Он является протеиновым экстрактом из культуры бруцелл. Положительной реакцией считают инфильтрат, покраснение размером 2x3 см и более, которые возникают через 24-48 часов. Аллергическая проба бывает положительной после перенесенного заболевания, а также у привитых. Это снижает диагностическую ценность пробы Бюрне.
Профилактика и лечение
В Украине проводится вакцино-профилактика бруцеллеза живой вакциной. Для предупреждения рецидивов применяют специфический иммуноглобулин, а также инактивированную вакцину. Для выявления ГЗТ используют бруцеллин-фильтрат убитой нагреванием бульонной культуры бруцелл. В качестве этиотропных химиотерапевтических препаратов используют антибиотики широкого спектра действия.